周 巧，張夢(mèng)梅，李建龍，胡凱弟，李 琴，劉書亮

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

擬除蟲菊酯（pyrethroids，PYRs）類農(nóng)藥由于其殺蟲譜廣、藥效高、對(duì)非靶標(biāo)生物毒性低，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和公共領(lǐng)域的蚊蟲和害蟲防治，是除有機(jī)磷農(nóng)藥之外的第二大類殺蟲劑，約占全球農(nóng)藥市場(chǎng)的30%以上[1]。PYRs具有光、熱穩(wěn)定性，在自然條件下很難快速降解，其殘留引起的環(huán)境污染和食品安全問題較為嚴(yán)重[2]。研究表明，PYRs可經(jīng)消化道、呼吸道和皮膚黏膜進(jìn)入機(jī)體，對(duì)微生物、水生動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物產(chǎn)生高度急性毒性，包括神經(jīng)毒性、免疫毒性和生殖毒性[3]，此外，PYRs的降解中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸（3-phenoxybenzoic acid，3-PBA）比母體農(nóng)藥更難降解，毒性更強(qiáng)，不僅是一種潛在的環(huán)境污染物，也是一種具有免疫毒性的內(nèi)分泌干擾物，可導(dǎo)致人體內(nèi)分泌代謝紊亂，同時(shí)3-PBA還能阻止微生物降解母體農(nóng)藥PYRs，其殘留進(jìn)一步加重了對(duì)環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品的污染[4]。因此，如何消減環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中PYRs和3-PBA殘留引起了廣泛關(guān)注。

物理、化學(xué)等農(nóng)殘降解方法因設(shè)施復(fù)雜昂貴和對(duì)環(huán)境安全性要求高而被限制，而微生物降解是一種安全、高效、廉價(jià)和沒有二次污染的修復(fù)方法，被認(rèn)為是治理農(nóng)藥環(huán)境污染和消減農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的有效途經(jīng)[5]。目前，微生物降解PYRs和3-PBA已被廣泛報(bào)道，現(xiàn)已篩選分離到較多PYRs和3-PBA降解細(xì)菌，如肺炎克雷伯桿菌、鞘氨醇單胞菌、鞘脂菌、假單胞菌、地衣芽孢桿菌等[6]，其研究也已深入到降解基因及降解酶的層面，如來源于不同細(xì)菌的estP、pytH、pytZ、pytY、est3385基因編碼的羧酸酯酶，estA基因編碼的脂肪酶，aps基因編碼的氨肽酶，chbE、rhe8、est2基因編碼的酯酶，以及pbaA1A2BC、dpeAlA2基因編碼的雙加氧酶已經(jīng)被分離鑒定并證明是PYRs及3-PBA降解的關(guān)鍵基因及關(guān)鍵酶[4,7]，關(guān)于細(xì)菌降解3-PBA的調(diào)控機(jī)制也有研究，來源于文新鞘脂菌（Sphingobium wenxiniae）JZ-1中的pbaA1A2B基因簇對(duì)3-PBA降解過程存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控，pbaA1A2B的特異性轉(zhuǎn)錄激活因子PbaR響應(yīng)3-PBA對(duì)pbaA1A2B基因簇進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活[8]。

絲狀真菌因其具有豐富的氧化酶系，對(duì)多種芳香族類化合物、殺蟲劑、染料等異生化合物具有較強(qiáng)的降解能力[9]，在生物修復(fù)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，相比于其他微生物，絲狀真菌是降解頑固異生化合物的優(yōu)勢(shì)物種，雖然現(xiàn)已有關(guān)于高效降解PYRs和3-PBA絲狀真菌的報(bào)道，如枝孢菌（Cladosporiumsp.）HU在5 d內(nèi)可完全降解100 mg/L的氰戊菊酯，米曲霉（Aspergillus oryzae）M4在72 h內(nèi)對(duì)100 mg/L的3-PBA降解率為80.1%，黑曲霉（Aspergillus niger）YAT1在22 h內(nèi)可完全降解100 mg/L的3-PBA[10]，但研究?jī)H停留在對(duì)降解菌的降解性質(zhì)和降解途徑方面，對(duì)降解酶的研究不深入，降解酶編碼的基因少見報(bào)道，降解機(jī)制的研究仍屬空白。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，可通過這些方法對(duì)絲狀真菌降解過程中的酶進(jìn)行挖掘，并闡明其降解機(jī)制，同時(shí)可以通過異源表達(dá)、基因敲除等方法對(duì)其降解酶的編碼基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。因此本文總結(jié)了降解PYRs和3-PBA的絲狀真菌、降解途徑及降解酶，詳述了降解酶基因的篩選與驗(yàn)證方法，這不僅可為絲狀真菌降解PYRs和3-PBA的降解途徑和降解機(jī)制的研究提供理論依據(jù)，也可為環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品的生物修復(fù)提供應(yīng)用參考。

1 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和3-苯氧基苯甲酸概述

1.1 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和3-苯氧基苯甲酸基本性質(zhì)

表1列出了PYRs和3-PBA結(jié)構(gòu)、種類和特點(diǎn)。PYRs是一種人工合成的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性與天然的除蟲菊酯類似，難溶于水，自然條件下不易分解。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒性，可將PYRs分I型和II型，I型缺乏氰基，主要包括丙烯菊酯和聯(lián)苯菊酯等；II型具有α-氰基，主要包括氯氰菊酯和溴氰菊酯等，比I型更具有神經(jīng)毒性[11]。

表1 PYRs和3-PBA結(jié)構(gòu)、種類及特點(diǎn)[11-12]Table 1 Structures,types and characteristics of PYRs and 3-PBA[11-12]

3-PBA是PYRs的主要代謝產(chǎn)物之一，純品為白色或淡黃色結(jié)晶狀粉末，熔點(diǎn)147～149 ℃，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，CAS登錄號(hào)為3739-38-6，分子式為C13H10O3，相對(duì)分子質(zhì)量為214.22。與PYRs相比，3-PBA結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，在自然條件下更難降解，極性更強(qiáng)，在土壤中的遷移速率也比PYRs快。根據(jù)土壤類型、氣候和其他條件，3-PBA在土壤中的半衰期一般為180 d，遠(yuǎn)超過PYRs[12]。

1.2 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和3-苯氧基苯甲酸殘留現(xiàn)狀及危害

PYRs由于低毒、高效被廣泛使用，其殘留問題也較嚴(yán)重，在土壤、空氣、水體及農(nóng)產(chǎn)品[13]中都有殘留的PYRs檢出，其中在蔬菜、水果、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中殘留檢出量為0.95～4 100.00 ng/g，且氯氰菊酯的檢出率最高[14]。隨著PYRs的廣泛使用，其主要代謝產(chǎn)物3-PBA在土壤、農(nóng)產(chǎn)品、人類尿液[1]及母乳[15]的檢出率也越來越高，是人類尿液中檢出率最高的異生物質(zhì)[16]。

PYRs殘留期雖短，但長(zhǎng)期低劑量接觸PYRs可導(dǎo)致慢性疾病。研究表明，PYRs具有影響離子通道、改變興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和擾動(dòng)氧化應(yīng)激水平等毒性作用，對(duì)腦組織產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷[17]，并對(duì)生物體的神經(jīng)、免疫、心血管和遺傳系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用[18]。此外，PYRs還可影響成年女性卵巢功能[19]、降低男性精子的質(zhì)量[20]、影響青少年聽力水平[21]和學(xué)齡兒童認(rèn)知水平[22]，孕早期暴露于PYRs中還可能影響2 歲兒童的神經(jīng)發(fā)育[23]等。而PYRs代謝產(chǎn)物3-PBA是一種抗雌激素類物質(zhì)，具有內(nèi)分泌干擾活性，也是一種多巴胺神經(jīng)毒素，可能導(dǎo)致生物體帕金森病[24]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，1 mg/L的3-PBA可引起斑馬魚胚胎心包水腫和心率降低[25]；尿液中的3-PBA可能與心血管疾病和冠心病的發(fā)病率增加有關(guān)[26]，成年男性尿液中3-PBA水平與血清甲狀腺素和總?cè)饧谞钕僭彼崴匠守?fù)相關(guān)，影響甲狀腺激素平衡[27]；3-PBA也有明顯的肝毒性，可通過調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶-3和B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。同時(shí)3-PBA具有一定抗微生物活性，如果不能被及時(shí)降解，會(huì)抑制微生物的代謝活性，進(jìn)一步阻礙母體農(nóng)藥的礦化降解，從而阻斷該類農(nóng)藥徹底轉(zhuǎn)化為無毒小分子物質(zhì)，間接地使環(huán)境、農(nóng)產(chǎn)品或食品中農(nóng)藥殘留問題更加嚴(yán)峻。

2 絲狀真菌降解PYRs和3-PBA的研究進(jìn)展

絲狀真菌一般指霉菌，是一種呈絲狀、無光合作用的廣泛分布于土壤、水域、空氣及動(dòng)植物體內(nèi)外等自然環(huán)境中的真核微生物，包括子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門。20世紀(jì)80年代中期，Science首次報(bào)道了可降解農(nóng)藥的白腐真菌[29]，隨后又發(fā)現(xiàn)了降解農(nóng)藥的新種曲霉屬，直至近幾年絲狀真菌降解農(nóng)藥的研究才陸續(xù)被報(bào)道。

絲狀真菌相較于其他微生物降解農(nóng)藥有以下幾方面的優(yōu)勢(shì)[30]：1）生物量更大而且遺傳特性更加穩(wěn)定，含有更多蛋白質(zhì)編碼基因；2）它可在任何基質(zhì)和惡劣的環(huán)境條件下生長(zhǎng)，存在于北極、深海、動(dòng)物及其遺骸、海藻、紅樹林和土壤中；3）含有包含內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶在內(nèi)的纖維素分解酶、木質(zhì)素分解酶和漆酶（laccase，Lac）等胞外酶和細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）等胞內(nèi)酶組成的獨(dú)特氧化酶系統(tǒng)，可降解二苯醚類、芳香族類、氯酚類、殺蟲劑及染料等物質(zhì)[31]。因此，絲狀真菌是農(nóng)藥降解的優(yōu)勢(shì)物種，并且許多絲狀真菌被歸類為公認(rèn)安全的（generally recognized as safe，GRAS）微生物，在消減農(nóng)產(chǎn)品及食品中農(nóng)藥殘留方面有較好的應(yīng)用前景。

絲狀真菌降解農(nóng)藥可通過不同機(jī)制來完成[30]，主要是礦化作用和共代謝作用。礦化作用是微生物以農(nóng)藥為唯一碳源和能源，使其徹底降解為水和二氧化碳；共代謝作用是微生物從其他底物獲取大部分或全部碳源和能源后將同一介質(zhì)中的農(nóng)藥進(jìn)行降解，通常對(duì)農(nóng)藥的降解不徹底，會(huì)產(chǎn)生并積累毒性化合物，共代謝作用可降解頑固化合物如氯化烯烴、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、殺蟲劑和藥物等，以該方式進(jìn)行降解的微生物廣泛存在于自然界中[32]。

2.1 降解PYRs和3-PBA的絲狀真菌

具有降解PYRs和3-PBA的微生物廣泛存在于自然界中，目前已篩選到大量可降解PYRs和3-PBA的絲狀真菌，表2和表3分別列出對(duì)PYRs和3-PBA具有降解能力的絲狀真菌。由表2可知，降解PYRs的絲狀真菌主要包括白腐真菌、曲霉屬、散囊屬、青霉屬、地霉屬、頂孢霉屬、枝孢屬、鐮刀菌屬等，其主要來源于土壤、農(nóng)藥廠污泥，其中枝孢菌（Cladosporiumsp.）HU[33]、曲霉菌（Aspergillussp.）PYR-P2[34]、鐮刀菌（Fusariumsp.）TS-203及毛鏈孢菌（Monilochaetessp.）TS-205[35]對(duì)100 mg/L的PYRs降解率大于90%。降解3-PBA的絲狀真菌相對(duì)較少，主要有曲霉屬、散囊屬、青霉屬、根霉屬等，其來源主要有黑茶、磚茶、醬醅及農(nóng)藥廠污泥，其中黑曲霉（Aspergillus niger）YAT1[36]、冠突散囊菌（Eurotium cristatum）ET1[37]、米曲霉（Aspergillus oryzae）M4[38]不僅對(duì)100 mg/L的3-PBA有較高的降解率，達(dá)到99%以上，并且它們還可以降解PYRs。

表2 降解PYRs的絲狀真菌Table 2 Filamentous fungi used for the degradation of PYRs

表3 降解3-PBA的絲狀真菌Table 3 Filamentous fungi used for the degradation of 3-PBA

單一微生物往往不具備礦化降解所需的酶系，加上母體農(nóng)藥產(chǎn)生的毒性代謝中間產(chǎn)物可能抑制微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致農(nóng)藥不能完全降解，因此篩選能夠同時(shí)降解PYRs和3-PBA的菌株或者通過微生物共培養(yǎng)的方式來完成對(duì)PYRs和3-PBA的完全降解尤為重要。

2.2 絲狀真菌對(duì)PYRs和3-PBA的降解途徑

目前，微生物降解3-PBA途徑已有研究，其中細(xì)菌對(duì)PYRs的降解大多是在羧酸酯酶、脂肪酶或者氨肽酶的作用下，使PYRs酯鍵斷裂生成3-PBA，然后3-PBA在苯氧基苯甲酸雙加氧酶的作用下，斷裂二苯醚鍵生成苯酚和原兒茶酸，生成的苯酚和原兒茶酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)最終生成水和二氧化碳[49]。絲狀真菌降解PYRs途徑如圖1所示（以氯氰菊酯為例），與細(xì)菌類似，即在酯酶作用下水解酯鍵生成二氯菊酸和α-氰基-3-苯氧基芐醇，后者自發(fā)轉(zhuǎn)化為3-苯氧基苯甲醛，然后氧化生成毒性比母體農(nóng)藥更強(qiáng)的3-PBA[39,50]。3-PBA在降解初期可被還原生成毒性相對(duì)較低的3-苯氧基芐醇，隨著3-PBA的降解和轉(zhuǎn)化，3-苯氧基芐醇又被氧化為3-PBA，這一現(xiàn)象可看作絲狀真菌的自轉(zhuǎn)保護(hù)機(jī)制[41]。

圖1 絲狀真菌降解PYRs的可能途徑Fig.1 Possible pathways of PYRs degradation by filamentous fungi

圖2總結(jié)了絲狀真菌降解3-PBA的兩條途徑。第一條途徑是3-PBA先羥基化生成HO-3-PBA后再斷裂醚鍵進(jìn)行降解。Chen Shaohua[33]、Birolli[40]和Deng Weiqin[42]等在絲狀真菌降解PYRs和3-PBA的體系中利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）儀在其代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到HO-3-PBA，推測(cè)在單加氧酶/羥化酶的作用下3-PBA可轉(zhuǎn)化為水溶性更強(qiáng)的HO-3-PBA，在一些研究中發(fā)現(xiàn)HO-3-PBA也可進(jìn)一步羥基化生成(HO)2-3-PBA[51]，但羥基化位點(diǎn)不能確定。隨后生成的HO-3-PBA在加氧酶的作用下繼續(xù)斷裂醚鍵生成苯酚、2,5-二羥基苯甲酸或?qū)Ρ蕉印?-羥基苯甲酸等產(chǎn)物，然后進(jìn)入下一步代謝生成水和二氧化碳。第二條途徑與部分細(xì)菌降解3-PBA途徑類似，即在苯氧基苯甲酸雙加氧酶的作用下直接斷裂醚鍵生成原兒茶酸和苯酚，如李金永等[37]在冠突散囊菌（Eurotium cristatum）ET1降解3-PBA特性研究中通過HPLC和GC-MS在代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到了苯酚和原兒茶酸，推測(cè)3-PBA可直接斷裂醚鍵生成苯酚和原兒茶酸。此外，李金永等[47]還分析了產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）QH、米曲霉（Aspergillus oryzae）MAY、高大毛霉（Mucor mucedo）MHC、黑根霉（Rhizopus nigricans）GH降解3-PBA的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)4 種霉菌降解3-PBA產(chǎn)生的新物質(zhì)存在差異，說明不同種類霉菌降解3-PBA途徑存在一定的差異，還有待進(jìn)一步研究。

圖2 絲狀真菌降解3-PBA的可能途徑[36-37]Fig.2 Possible pathways of 3-PBA degradation by filamentous fungi[36-37]

目前絲狀真菌降解PYRs和3-PBA的代謝產(chǎn)物鑒定方法主要是利用HPLC、GC-MS、LC-MS，但這些方法對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)中的化合物難以進(jìn)行準(zhǔn)確定性，高分辨質(zhì)譜（high-resolution mass spectrometry，HRMS）技術(shù)具有選擇性強(qiáng)、良好的質(zhì)量精度、高分辨率、高采集速率及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，不僅提高了對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)的準(zhǔn)確性，而且有助于識(shí)別可疑或未知化合物[52]，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品安全等領(lǐng)域的檢測(cè)分析，這為鑒定PYRs和3-PBA的代謝產(chǎn)物提供了一種新的方法。此外，還可結(jié)合核磁共振技術(shù)、傅里葉變換紅外光譜技術(shù)，全方位、多視角對(duì)未知代謝產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析鑒定。

2.3 絲狀真菌的PYRs和3-PBA降解酶

2.3.1 PYRs降解酶

微生物對(duì)PYRs的降解主要是通過產(chǎn)生的酶來降解，這一過程涉及水解酶和氧化還原酶，水解酶主要有酯酶、脂酶、肽酶等，氧化還原酶主要有加氧酶、過氧化物酶等。目前對(duì)絲狀真菌的PYRs降解酶的研究?jī)H停留在酶的定位、降解性能以及純化等方面。秦坤[53]提取了高效降解氯氰菊酯鐮刀菌（Fusariumsp.）TS-203的胞外和胞內(nèi)酶液，利用HPLC測(cè)定氯氰菊酯降解率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10 min內(nèi)胞內(nèi)酶對(duì)100 mg/L氯氰菊酯降解率為59.8%，胞外酶為10.3%，確定了鐮刀菌氯氰菊酯降解酶主要是胞內(nèi)酶。此外，對(duì)氯氰菊酯胞內(nèi)酶降解特性進(jìn)行研究，得出該酶最適pH值為7.0，最適溫度為30 ℃，且有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。Liang Weiqian等[54]通過凝膠過濾層析從黑曲霉（Aspergillus niger）ZD11中分離純化了PYRs水解酶，該酶分子質(zhì)量大約為56 kDa，最適溫度為45 ℃，最適pH值為6.5，純化的酶具有廣泛的底物特異性，可降解具有結(jié)構(gòu)類似羧酸酯的農(nóng)藥，如氯氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯和有機(jī)磷農(nóng)藥馬拉硫磷，對(duì)氯菊酯有最高的酶活，對(duì)反式氯菊酯的比活力為31.1 U/mg，對(duì)順式氯菊酯的比活力為29.3 U/mg。此外，該酶還可降解短中鏈脂肪酸的F-硝基苯酯。

大多數(shù)PYRs的降解酶屬于水解酶家族的酯酶，在PYRs降解中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)已從微生物、昆蟲、動(dòng)植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了不同的擬除蟲菊酯降解水解酶[55]，不同來源的PYRs水解酶的類型和特性雖然各不相同，但是這些酶的活性位點(diǎn)氨基酸具有共同的保守位點(diǎn)——包含1 個(gè)絲氨酸、組氨酸和谷氨酰胺的三聯(lián)催化體，并且具有相似的催化機(jī)制，均為催化酯鍵水解[56]。

2.3.2 3-PBA降解酶

細(xì)菌的3-PBA降解酶大多是斷裂醚鍵的雙加氧酶或單加氧酶，如梁俊仕等[57]對(duì)來自不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）4-D的3-PBA降解關(guān)鍵酶基因d34進(jìn)行克隆表達(dá)，經(jīng)同源比對(duì)和酶活力驗(yàn)證，證實(shí)該基因編碼的酶為鄰苯二酚雙加氧酶；Wang Chenghong等[58]在文新鞘脂菌（Sphingobium wenxiniae）JZ-1中發(fā)現(xiàn)一段可編碼降解3-PBA的1’,2’-雙加氧酶基因簇pbaA1A2B，可催化3-PBA生成3-羥基苯甲酸和兒茶酚，該基因是非組成型表達(dá)，受底物3-PBA的誘導(dǎo)，該基因簇編碼的1’,2’-雙加氧酶屬于IV型Rieske非血紅素鐵芳香環(huán)羥基化加氧酶系統(tǒng)，由雜低聚加氧酶、[2Fe-2S]型鐵氧還蛋白和谷胱肝肽還原酶型還原酶組成。此外，3-PBA的徹底降解還涉及苯酚羥化酶、鄰苯二酚1,2-雙加氧酶和原兒茶酸3,4-雙加氧酶[3]。

目前關(guān)于絲狀真菌3-PBA降解酶的研究較少，多為對(duì)降解菌株產(chǎn)降解酶條件的優(yōu)化及對(duì)其降解酶性質(zhì)的研究，如瑜志強(qiáng)等[59]對(duì)米曲霉（Aspergillus oryzae）M4產(chǎn)3-PBA降解酶進(jìn)行研究，提取了米曲霉的胞內(nèi)酶和胞外酶粗酶液，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)酶比胞外酶對(duì)3-PBA有更強(qiáng)的降解能力，對(duì)胞內(nèi)酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值和溫度可顯著影響降解酶的酶活力和酶穩(wěn)定性，且該酶在pH 7.0、30 ℃時(shí)有最高的酶活力。僅有少數(shù)研究報(bào)道了絲狀真菌的3-PBA降解酶，如Zhao Jiayuan等[60]通過添加酶抑制劑和誘導(dǎo)劑對(duì)米曲霉M4降解3-PBA及其中間代謝產(chǎn)物的降解酶及途徑進(jìn)行了研究，結(jié)果表明CYP450、木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）、Lac及雙加氧酶參與了3-PBA及其中間代謝產(chǎn)物的降解，其中CYP450和LiP是將3-PBA轉(zhuǎn)化為苯酚和沒食子酸所需的酶，Lac和雙加氧酶是將苯酚和沒食子酸轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈烯酸或烯烴醛的酶；Deng Weiqin等[42]通過測(cè)定黑曲霉YAT對(duì)β-氯氰菊酯和3-PBA的降解產(chǎn)物及降解酶活力，推測(cè)雙加氧酶參與了3-PBA、原兒茶酸和鄰苯二酚的降解。

此外，3-PBA是二苯醚鍵結(jié)構(gòu)類似物，據(jù)報(bào)道，二苯醚結(jié)構(gòu)類似物如2-PBA、木質(zhì)素、纖維素等可被Lac、錳過氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，MnP）、LiP等胞外酶，CYP450胞內(nèi)酶和各種雙加氧酶等氧化還原酶降解[61]，包括米曲霉在內(nèi)的許多絲狀真菌都有這些酶及編碼基因[62]，因此，可以推斷這些氧化還原酶在絲狀真菌降解3-PBA過程中起重要作用，其中絲狀真菌CYP450與農(nóng)藥代謝關(guān)系密切，主要通過單加氧酶反應(yīng)來催化農(nóng)藥的降解，常見反應(yīng)包括羥基化、環(huán)氧化、雙羥基化、O-脫烷基反應(yīng)等[63]。Elisabet等[64]研究發(fā)現(xiàn)，單純的胞內(nèi)酶或胞外酶難以有效降解與3-PBA結(jié)構(gòu)類似的木質(zhì)素類化合物，微生物共代謝降解木質(zhì)素類化合物需要胞內(nèi)CYP450和胞外酶共同作用才能實(shí)現(xiàn)高效降解。下面將介紹絲狀真菌中可能參與3-PBA降解的酶。

2.3.2.1 胞外酶

絲狀真菌可分泌LiP、MnP和Lac等胞外酶。LiP是一系列含有Fe(III)-卟啉環(huán)(IX)血紅素輔基的同功酶，不僅可以降解木質(zhì)素，還能降解生態(tài)系統(tǒng)中的農(nóng)藥和抗生素等有機(jī)化合物[65]，但天然LiP產(chǎn)量低，底物譜有限，耐受能力不強(qiáng)，降解有機(jī)污染物的效果不佳[66]。MnP是一種依賴Mn2+的含血紅素的過氧化物酶，是一種非特異性酶，它作用底物廣泛，可降解有機(jī)氯、有機(jī)磷等農(nóng)藥、含胺芳香族化合物和染料等化合物[67]，如產(chǎn)自白腐真菌的MnP在3 d內(nèi)可將30 mg/L的毒死蜱降解77.51%[68]。Lac是一種多銅氧化酶，普遍存在于植物和許多真菌中，其中真菌Lac廣泛分布于白腐真菌、腐生真菌和菌根真菌中，尤以白腐真菌的研究和應(yīng)用最廣泛，是目前真菌領(lǐng)域中最重要的漆酶產(chǎn)生者[69]。Lac具有廣泛的底物特異性，不僅可將木質(zhì)素降解生成二氧化碳和水，還可對(duì)殺蟲劑、染料和農(nóng)藥等難降解化合物進(jìn)行降解，如輪紋韌革菌、朱紅密孔菌產(chǎn)生的Lac在1 d內(nèi)可降解90%土壤中0.3 mg/kg的嘧菌酯[70]；重組畢赤酵母產(chǎn)生的Lac在香草醛介體的存在下在1 d內(nèi)對(duì)25 mg/mL的毒死蜱降解率達(dá)98%[71]。絲狀真菌產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶系如LiP、MnP、Lac由于具有降解底物的非專一性，因此有廣譜的生物降解性，對(duì)不同農(nóng)藥也有較好的降解效果，但在不同物質(zhì)的刺激下產(chǎn)生的胞外木質(zhì)素降解酶不同，因而對(duì)不同農(nóng)藥的降解能力和效果不同，對(duì)不同農(nóng)藥的降解機(jī)制也有待研究。

2.3.2.2 胞內(nèi)酶CYP450

CYP450占所有I相外源性代謝酶的70%～80%[72]，被認(rèn)為是絲狀真菌降解有毒有害物質(zhì)過程中的關(guān)鍵酶。CYP450屬于單加氧酶的一類，是一類分子質(zhì)量在46～60 kDa、結(jié)構(gòu)多樣、功能多樣的超基因家族酶，主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，大多數(shù)屬于膜蛋白。在進(jìn)行物質(zhì)代謝過程中，在氧化還原反應(yīng)中發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide，NAD(P)H）是電子供體而底物是電子受體，從而發(fā)揮CYP450的一系列生物學(xué)功能。依據(jù)氧化還原伴侶的不同類型可以將CYP450催化系統(tǒng)分為5 類[73]（圖3）：第一類是以CYP450、含鐵硫簇（Fe2S2）的鐵氧還原蛋白（ferredoxin，F(xiàn)dx）以及含有一分子黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）的鐵氧還原蛋白還原酶（ferredoxin reductase，F(xiàn)dR）的三組分系統(tǒng)，原核生物和真核生物線粒體中的CYP450通常屬于此類；第二類為雙組分系統(tǒng)，大多數(shù)是真核生物（動(dòng)植物及真菌等）來源的CYP450，其氧化還原伴侶為同時(shí)含有FAD和黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）的CYP450還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR），大多以膜蛋白的形式存在；第三類CYP450酶與CPR天然融合；第四類系統(tǒng)中CYP450結(jié)構(gòu)域與含有Fe2S2/FMN的氧化還原伴侶結(jié)構(gòu)域天然融合；第五類是自然界中存在少部分不需要氧化還原伴侶的CYP450酶，它們可以直接從NAD(P)H獲取電子。

圖3 CYP450催化系統(tǒng)類型[73]Fig.3 Types of CYP450 catalytic system[73]

Vasconcelos等[74]發(fā)現(xiàn)，海洋真菌（Olypocladiumsp.）CBMAI 1346對(duì)芘的降解主要由CYP450單加氧酶引發(fā)，它可與環(huán)氧水解酶結(jié)合將芘羥基化為4,5-反式二羥基芘后進(jìn)行降解；Hata等[75]在白腐真菌（Phanerochaete sordida）YK-624消除雙氯酚酸和甲芬那酸的研究中，利用質(zhì)譜和核磁共振在代謝產(chǎn)物中檢測(cè)到了羥基雙氯酚酸和羥基甲酚那酸，并通過添加CYP450抑制劑1-氨基苯并三唑來抑制降解體系中的羥基雙氯酚酸和羥基甲酚那酸的生成，說明白腐真菌中CYP450催化的羥基化反應(yīng)可能參與雙氯芬酸和甲芬那酸的降解反應(yīng)，表明CYP450在難降解化合物的代謝中發(fā)揮核心作用[76]。絲狀真菌中的部分編碼CYP450的P450s基因具有降解環(huán)境污染物的能力[63]，來源于子囊菌科的絲狀真菌黑曲霉和構(gòu)巢曲霉中的CYP53A基因可以使苯甲酸羥基化以及其他單取代苯甲酸衍生物形成羥基化產(chǎn)物，經(jīng)過β-酮己二酸途徑對(duì)有毒有害物質(zhì)進(jìn)行降解[77]；Trippe等[78]克隆鑒定了黏束梗霉（Graphiumsp.）ATCC58400中的CYP52L1基因，功能上表征為環(huán)氧化的CYP450，通過CYP52L1基因沉默降低了黏束梗霉的氧化烷烴和醚的能力，說明CYP52L1基因參與了烷烴和醚的初始降解。

目前，已有大量研究證明絲狀真菌CYP450酶系在降解農(nóng)藥中發(fā)揮重要作用，CYP450通過不同機(jī)制如羥基化、脫烷基化、環(huán)氧化、脫鹵化等對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行降解，其中最主要的是羥基化反應(yīng)，通過添加羥基的方式增加污染物的水溶性，形成不穩(wěn)定的羥基化產(chǎn)物，進(jìn)而生成共軛產(chǎn)物或者直接被礦化降解。

3 降解酶基因的篩選與驗(yàn)證

研究酶的傳統(tǒng)方法是將酶從野生菌株的組織或細(xì)胞中提取出來并將其分離純化，此法過程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，難以大量生產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)農(nóng)藥降解酶的研究不再局限于傳統(tǒng)的分離純化鑒定，目前常通過多種組學(xué)技術(shù)，如全基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白組學(xué)等對(duì)降解過程涉及的酶及其編碼的基因進(jìn)行研究[79]，但是目前對(duì)于絲狀真菌代謝過程關(guān)鍵降解酶篩選技術(shù)尚不成熟，并且難度較大，關(guān)于絲狀真菌降解PYRs及3-PBA過程的降解酶及其相關(guān)酶的編碼基因這一領(lǐng)域的研究仍屬空白，還有待進(jìn)一步探索。

3.1 酶基因的篩選方法

3.1.1 基于基因組學(xué)篩選

基因組是生物體內(nèi)包含的完整基因和染色體?；蚪M學(xué)是應(yīng)用DNA重組、測(cè)序及生物信息學(xué)分析對(duì)基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析。自2001年，模式絲狀真菌粗糙脈孢菌基因序列被公布，曲霉、木霉等絲狀真菌也相繼完成全基因組測(cè)序[80]。全基因組測(cè)序可深入分析微生物基因組序列，通過基因序列比較分析可發(fā)現(xiàn)大量功能類似的基因。對(duì)于農(nóng)藥降解基因研究，可在已完成測(cè)序的基因組序列的基礎(chǔ)上，通過序列比對(duì)尋找農(nóng)藥降解基因或相似基因，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全基因組測(cè)序?yàn)殍b定和發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥降解酶基因及相似序列提供了一種高效、快捷的方法[81]。方連城[82]對(duì)毒死蜱降解菌南通嗜銅菌（Cupriavidus nantongensis）X1進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定了毒死蜱降解過程中的關(guān)鍵基因OPH以及毒死蜱降解產(chǎn)物3,5,6-三氯-2吡啶醇（3,5,6-trichloro-2-pyridinol，TCP）降解的關(guān)鍵基因TcpA，得到了毒死蜱在南通嗜銅菌XI中的代謝路徑。馬嘉雯[83]對(duì)高效降解三苯基錫的蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）GIMCC1.817進(jìn)行全基因組測(cè)序，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)注釋比對(duì)，結(jié)合目標(biāo)代謝產(chǎn)物分析，推測(cè)參與三苯基錫芳香環(huán)裂解的加氧酶主要是CYP450和脫氫酶。

3.1.2 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選

轉(zhuǎn)錄組是指細(xì)胞在特定條件下轉(zhuǎn)錄的全部RNA的總和，是遺傳信息和蛋白功能之間的紐帶。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可研究某一特定條件下，生物樣本體內(nèi)RNA序列的表達(dá)情況，是研究細(xì)胞表型和功能的重要手段，在許多領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，對(duì)深入挖掘生物體內(nèi)各反應(yīng)的分子機(jī)理具有重大意義。2006年，Abe等[84]對(duì)A.oryzae基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析鑒別出新的代謝產(chǎn)物，為開發(fā)新型酶蛋白提供了一種新技術(shù)，隨后轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在絲狀真菌領(lǐng)域中應(yīng)用越來越廣泛，技術(shù)也越來越成熟。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)蜻M(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集、基因表達(dá)量差異分析，進(jìn)而進(jìn)行功能和代謝通路分析，從而篩選出目標(biāo)基因。通過對(duì)農(nóng)藥降解菌轉(zhuǎn)錄組的研究，可以探尋降解菌在農(nóng)藥作用下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步篩選鑒定農(nóng)藥降解關(guān)鍵酶及編碼基因，也為發(fā)現(xiàn)新的農(nóng)藥降解酶及編碼基因提供一種新穎且有效的技術(shù)方法。

Cheng Yi等[85]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究推導(dǎo)了紅球菌（Rhodococcus erythropolis）D310-1對(duì)除草劑氯嘧磺隆降解的關(guān)鍵基因，對(duì)差異表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行GO和KEGG注釋以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative tealtime polymerase chain reaction，qPCR）驗(yàn)證，表明羧酸酯酶基因、CYP450基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因在氯嘧磺隆生物降解過程中起關(guān)鍵作用。Zhang Cheng等[86]采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了吉林克雷伯氏菌（Klebsiella jilinsis）2N3降解氯嘧磺隆的分子機(jī)制，預(yù)測(cè)硫代謝是降解過程中的關(guān)鍵途徑，降解過程中羧酸酯酶、單加氧酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和CYP450的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，表明這些酶是降解過程中的關(guān)鍵酶。Long Zhengnan等[87]等對(duì)多菌靈降解菌-紅球菌（Rhodococcussp.）CX-1進(jìn)行了全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，提出了多菌靈降解的可能途徑和機(jī)制，多菌靈首先在mhel基因編碼的水解酶的作用下被水解生成2-氨基苯并咪唑，然后在hdx基因編碼的羥化酶作用下生成2-羥基苯并咪唑，然后在mno、benA基因編碼酶的作用下轉(zhuǎn)化為兒茶酚，最后兒茶酚進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行降解最終生成H2O和CO2。Wang Beijia等[88]對(duì)降解雙酚A的乳白原毛平革菌（Phanerochaete sordida）YK-624進(jìn)行RNA測(cè)序分析該菌降解機(jī)制，對(duì)上調(diào)基因進(jìn)行KEGG和GO富集分析，結(jié)果顯示編碼Lip和CYP450的基因表達(dá)量顯著上調(diào)，表明Lip和CYP450可能參與了乳白原毛平革菌對(duì)雙酚A的降解。

3.1.3 基于蛋白組學(xué)篩選

蛋白組學(xué)是探究細(xì)胞、組織和生物體蛋白質(zhì)組的組成及變化規(guī)律的科學(xué)，可以分析降解過程中酶系組成和表達(dá)量，是對(duì)蛋白質(zhì)組的表征，是理解基因功能的重要方法之一[89]。蛋白組學(xué)初期主要以通量低，靈敏度低的雙向熒光差異凝膠電泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2-DIGE）和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）方法為主，隨著HPLC技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，基于LC-MS/MS的3D蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為主流方法，現(xiàn)在隨著高精密度質(zhì)譜的出現(xiàn)與成功應(yīng)用，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)進(jìn)入4D的高通量時(shí)代[90]。

傳統(tǒng)的農(nóng)藥微生物降解研究主要是對(duì)單一酶進(jìn)行鑒定和表征，但是微生物降解是由蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)及其在細(xì)胞內(nèi)的相互作用介導(dǎo)的復(fù)雜過程，使用蛋白質(zhì)組學(xué)研究農(nóng)藥生物降解過程，可以確定降解過程的相關(guān)酶、主要代謝途徑以及活性氧產(chǎn)生的氧化應(yīng)激解毒機(jī)制。Liu Huan等[91]利用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（isobaric tag for relative and absolute quantification-liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，iTRAQ-LC-MS/MS）技術(shù)研究了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）SJTD-1對(duì)十八烷的代謝機(jī)制，鑒定出383 個(gè)烷烴反應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)了編碼參與烷烴羥基化的單加氧酶基因，主要包括烷烴羥化酶基因alKB2和單加氧酶基因almA。Otzen等[92]對(duì)降解己內(nèi)酰胺的耶氏假單胞菌（Pseudomonas jessenii）GO3使用基于定量質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了參與己內(nèi)酰胺代謝的蛋白質(zhì)和基因，確定了參與己內(nèi)酰胺開環(huán)生成6-氨基己酸的ATP依賴性內(nèi)酰胺酶和將6-氨基己酸轉(zhuǎn)化為6-氧代己酸的轉(zhuǎn)氨酶。劉晴[93]為了探究短密木霉（Trichodermta brevicompactum）降解米唑乙煙酸的蛋白質(zhì)表達(dá)變化和相關(guān)代謝途徑，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，隨后將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選出TBU3981A和TBU1425AL兩個(gè)基因作為短密木霉降解米唑乙煙酸的候選基因。近年來越來越多的研究將蛋白質(zhì)組學(xué)方法應(yīng)用于農(nóng)藥生物降解領(lǐng)域，這為全面深入研究微生物降解農(nóng)藥途徑和降解機(jī)制提供了一種新的方法。

3.2 酶基因的功能驗(yàn)證

3.2.1 異源表達(dá)

在進(jìn)行酶功能驗(yàn)證中最常規(guī)的方式就是克隆得到目的基因，構(gòu)建表達(dá)載體以獲得重組蛋白來檢測(cè)酶活力，對(duì)酶的性質(zhì)和功能進(jìn)行研究。表達(dá)系統(tǒng)主要可分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。表4列出了不同類型的異源表達(dá)系統(tǒng)、常用宿主細(xì)胞及表達(dá)的優(yōu)缺點(diǎn)。原核表達(dá)系統(tǒng)宿主主要包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，真核表達(dá)系統(tǒng)宿主主要包括釀酒酵母、畢赤酵母和黑曲霉、米曲霉等絲狀真菌。

表4 幾種常用的不同類型的異源表達(dá)系統(tǒng)Table 4 Several different types of commonly used heterologous expression systems

大腸桿菌是常用的原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主，具有操作簡(jiǎn)單、技術(shù)成熟、周期短、表達(dá)量大等優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)來源于真核生物的基因在進(jìn)行表達(dá)時(shí)常出現(xiàn)蛋白質(zhì)無法正確折疊，缺少糖基化修飾等問題，形成不溶的無活性的包涵體[94]。如真核CYP450大多數(shù)位于線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜蛋白上，難以在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，這主要是因?yàn)檎婧薈YP450的N端疏水性對(duì)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位起著重要指導(dǎo)作用，這些序列可被識(shí)別，并轉(zhuǎn)移至真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或原核生物的細(xì)胞質(zhì)膜，輔助其正確表達(dá)，而大腸桿菌缺乏細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)，無法提供真核CYP450正確錨定位置，導(dǎo)致真核CYP450無法在大腸桿菌中進(jìn)行正確表達(dá)。解決方法主要有N端序列修飾與分子伴侶共表達(dá)，降低誘導(dǎo)溫度，密碼子的優(yōu)化，培養(yǎng)時(shí)添加醇類、蔗糖等蛋白可溶性添加劑，這些是實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的有效策略[97]。

枯草芽孢桿菌屬于GRAS微生物，作為原核表達(dá)宿主具有良好的性能，包括無明顯的密碼子偏好性、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單、容易進(jìn)行高密度發(fā)酵等，使其成為食品、飼料等行業(yè)中的理想表達(dá)宿主[99]。但是枯草芽孢桿菌在表達(dá)異源蛋白時(shí)，自身分泌的多種酶可能會(huì)將重組蛋白降解，存在表達(dá)的異源蛋白不穩(wěn)定的缺陷[100]。

畢赤酵母含有醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）啟動(dòng)子，可用甲醇誘導(dǎo)調(diào)控外源基因的表達(dá)，既可實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)，也可實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá)，與釀酒酵母相比，發(fā)酵產(chǎn)物不產(chǎn)生乙醇，不會(huì)對(duì)酵母生長(zhǎng)有影響，大大提高了表達(dá)效率，適合大批量發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白。

黑曲霉和米曲霉也屬于GRAS微生物，作為絲狀真菌表達(dá)宿主，可進(jìn)行高效表達(dá)、高分泌及糖基化修飾和二硫鍵修飾等多種翻譯后加工，使得許多高附加價(jià)值的蛋白都實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用[101]。但是絲狀真菌作為表達(dá)宿主時(shí)也會(huì)出現(xiàn)異源蛋白被降解的情況，因此需要抑制絲狀真菌自身的蛋白酶系統(tǒng)，減少重組蛋白酶的降解[102]。

大腸桿菌雖然是最簡(jiǎn)單和最常用的表達(dá)系統(tǒng)，但是在表達(dá)真核基因時(shí)可能出現(xiàn)酶活性較低或者形成無活性包涵體的情況，并且表達(dá)的酶分泌在胞內(nèi)，后續(xù)提取酶的過程相對(duì)較為復(fù)雜。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前研究最透徹、基因操作技術(shù)較成熟及應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠穩(wěn)定地表達(dá)外源蛋白，并且可實(shí)現(xiàn)胞外分泌表達(dá)，是表達(dá)真核基因的一個(gè)很好選擇。目前，已有較多絲狀真菌酶基因?qū)崿F(xiàn)了在畢赤酵母中的高效表達(dá)，如來源于如黑曲霉的果膠酯酶基因[103]、煙曲霉Z5中內(nèi)切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶基因[104]、米根霉的脂類水解酶基因[105]、米曲霉中的裂解性多糖單加氧酶基因[106]、白腐真菌的漆酶基因[107]以及真核CYP450基因[108]等。雖然絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)胞外分泌效率高、表達(dá)量大、分泌產(chǎn)生的外源蛋白有優(yōu)良的天然活性，但在實(shí)際操作及應(yīng)用中還存在許多問題，如背景復(fù)雜的宿主細(xì)胞分泌產(chǎn)生的外源蛋白酶容易被自身分泌的酶降解，一些異源蛋白在絲狀真菌中無法實(shí)現(xiàn)表達(dá)以及大量表達(dá)，遺傳轉(zhuǎn)化操作相對(duì)困難[109]，因此還需要對(duì)宿主細(xì)胞及蛋白表達(dá)元件進(jìn)行優(yōu)化改造，以期獲得高生長(zhǎng)速率、便捷遺傳轉(zhuǎn)化、高效率蛋白質(zhì)合成以及低分泌背景的絲狀真菌[110]。

3.2.2 基因敲除

基因敲除是研究絲狀真菌基因功能的重要方法之一，可直接對(duì)基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，其原理是利用同源重組技術(shù)定點(diǎn)置換目的基因，通過抑制目的基因的正常表達(dá)、檢測(cè)基因缺失菌株各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，推斷該基因的生物學(xué)功能[111]。基因敲除步驟主要包括敲除載體的構(gòu)建、敲除載體的轉(zhuǎn)化、目的敲除子的篩選及轉(zhuǎn)化子的鑒定，傳統(tǒng)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[112]，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定遺傳，是目前最常用的轉(zhuǎn)化方法?；蚯贸夹g(shù)雖然是研究基因功能和結(jié)構(gòu)的最直接最有效的方法之一，但是目前對(duì)絲狀真菌的基因敲除技術(shù)還存在一些困難，主要包括獲得所需打靶載體費(fèi)時(shí)費(fèi)力、需要較長(zhǎng)的同源序列、發(fā)生同源重組的頻率低和打靶效率低[113]。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，絲狀真菌簡(jiǎn)單、快捷、高效率遺傳轉(zhuǎn)化操作體系逐漸建立起來，其中成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9，CRISPR/Cas9）操作簡(jiǎn)單、定位精確、轉(zhuǎn)化效率高，在各研究領(lǐng)域迅速發(fā)展[114]，這對(duì)研究絲狀真菌功能基因、代謝調(diào)控、代謝產(chǎn)物具有重要意義和價(jià)值。

4 結(jié)語

對(duì)于食品中農(nóng)藥殘留的消減，保證菌株本身安全性及農(nóng)藥降解產(chǎn)物無毒無害是目前亟待解決的問題。因此，從食品原料或發(fā)酵食品中篩選降解菌株，揭示其降解途徑并闡明降解機(jī)理，判斷菌株對(duì)農(nóng)藥的降解否完全、降解產(chǎn)物是否無毒，對(duì)食品中PYRs和3-PBA的消減具有重要意義。目前已篩選到降解PYRs和3-PBA的絲狀真菌，并對(duì)其降解特性和降解途徑進(jìn)行了研究，但是對(duì)PYRs和3-PBA降解過程的相關(guān)酶、編碼基因及其降解機(jī)制方面的研究尚屬空白。本文通過綜述絲狀真菌降解PYRs和3-PBA的研究進(jìn)展，提出今后的研究方向：1）降解PYRs和3-PBA的絲狀真菌來源廣泛，但大多來自被農(nóng)藥污染的土壤和水體，菌株安全性難以保障，因此篩選食品來源的高效降解菌對(duì)食品中殘留PYRs和3-PBA的消減有重要意義；2）絲狀真菌降解PYRs和3-PBA途徑大多是通過HPLC、LC-MS、GC-MS等對(duì)其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，存在難以對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定性的問題，可借助HRMS技術(shù)、紅外光譜和核磁共振技術(shù)等對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分析從而推斷其降解途徑；3）為闡明絲狀真菌降解PYRs和3-PBA的機(jī)制，需要對(duì)降解過程中的酶及其編碼基因進(jìn)行研究，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，可以借助基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法挖掘降解過程中涉及的酶及其編碼基因從而闡明降解機(jī)制；4）對(duì)篩選的關(guān)鍵基因利用食品級(jí)宿主枯草芽孢桿菌或米曲霉和黑曲霉等絲狀真菌構(gòu)建基因工程菌并獲得重組酶，為農(nóng)產(chǎn)品中PYRs和3-PBA殘留消減應(yīng)用提供參考。