鄧 梅,張 露,,*,羅 晶,彭春彥,丁 翹,蘆 玲,魏林峰,涂宗財(cái),3
(1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,江西 南昌 330022;2.江西德上制藥股份有限公司,江西 樟樹 331200;3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種復(fù)發(fā)性炎癥性腸病,作為炎癥性腸病的主要類型之一,UC的主要特征表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、腹痛、腹瀉和便血[1]。盡管UC在西方國(guó)家更為普遍,但近年來(lái)發(fā)展中國(guó)家的UC發(fā)病率也急劇增加,這導(dǎo)致UC成為21世紀(jì)全球健康問(wèn)題之一[2]。UC的發(fā)生與多種因素密切相關(guān),包括遺傳因素、環(huán)境因素、免疫調(diào)節(jié)、腸道微生物和生活方式等,其確切的發(fā)病機(jī)制仍尚未明確,且目前還未找到有效的治愈方式[3]。常規(guī)的UC干預(yù)藥物包括皮質(zhì)類固醇、5-氨基水楊酸、免疫抑制劑和抗生素等,但效果有限并伴有一系列的副作用,長(zhǎng)期服用產(chǎn)生的毒性也會(huì)限制其療效[4]。因此,探索安全有效的預(yù)防或改善UC的方式至關(guān)重要。
近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明,食物中的許多活性成分,例如多酚、多糖、膳食纖維以及多肽等,均可積極地影響免疫反應(yīng)、腸道屏障功能和腸道微生物構(gòu)成,并進(jìn)一步改善腸炎損傷癥狀[5]。食源性生物活性肽通常指通過(guò)酶解食物蛋白質(zhì)產(chǎn)生的具有生理調(diào)節(jié)功能的寡肽或多肽,可通過(guò)與腸道菌群相互作用對(duì)人體產(chǎn)生有益作用,主要體現(xiàn)在降血脂、調(diào)節(jié)血壓、抗衰老以及抗腸道炎癥等方面,具有良好的安全性、吸收性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。已有研究表明,生物活性肽可能參與調(diào)節(jié)腸道菌群組成,進(jìn)而參與免疫反應(yīng),維持腸道健康,有利于炎癥性腸病患者的康復(fù)[7]。研究發(fā)現(xiàn),雞卵清肽可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成,顯著增加Candidatus saccharimonas和Lactobacillus等有益菌屬的豐度,減輕葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型小鼠的結(jié)腸炎癥狀[5]。
烏骨雞(Gallus gallus domesticlusBrisson)又名烏雞、絲毛烏骨雞等,屬雉科動(dòng)物,是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用雞種[8-9]。研究表明,烏骨雞肉中含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、黑色素、礦物質(zhì)和微量元素等營(yíng)養(yǎng)素[10],具有提高免疫力、改善虛弱和消瘦、緩解月經(jīng)異常和產(chǎn)后并發(fā)癥等藥用特性[11-12]。烏雞肽是烏雞肉經(jīng)酶解后獲得的蛋白酶解液,其中的小分子肽不需要進(jìn)行額外的消化便可被人體吸收,其吸收更具完整性和主動(dòng)性[13]。研究發(fā)現(xiàn),烏雞肽具有抗氧化、抗衰老、降血壓、補(bǔ)血等多種生理活性[14],但目前還鮮有關(guān)于烏雞肽結(jié)腸炎保護(hù)作用及其潛在機(jī)制的研究報(bào)道。
因此,本研究采用DSS構(gòu)建結(jié)腸炎小鼠模型,通過(guò)比較小鼠體質(zhì)量、血便、腹瀉、結(jié)腸長(zhǎng)度、炎癥因子、結(jié)腸組織病理、腸道微生物構(gòu)成以及短鏈脂肪酸含量等生化和病理指標(biāo)的變化,探究烏雞肽對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的保護(hù)作用,并從腸道菌群變化角度初步分析其作用機(jī)制,為烏雞肽的高值化利用提供參考依據(jù)和理論指導(dǎo)。
C57BL/6J雄性小鼠,7 周齡,體質(zhì)量為(20±2)g,SPF級(jí),購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2021-0006。小鼠飼養(yǎng)在溫度22~24 ℃、相對(duì)濕度60%~80%、12 h/12 h明暗交替的環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)獲得南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào):0064257)。
烏雞肽 江西倍得力生物工程有限公司;DSS 美國(guó)MP Biomedical公司;糞便隱血試劑盒 珠海貝索生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、IL-1β、BCA蛋白濃度試劑盒 江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染液套裝武漢賽維爾生物科技有限公司;4%多聚甲醛通用型組織固定液 合肥Biosharop公司;柳氮磺吡啶腸溶片上海信誼天平藥業(yè)有限公司。
Synergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;HYQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;5430R冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司;超濾離心管美國(guó)Millipore公司;JB-P5包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司;RM2016病理切片機(jī) 德國(guó)徠卡儀器有限公司。
1.3.1 烏雞肽基本成分分析、分子質(zhì)量分布以及氨基酸組成測(cè)定
參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定烏雞肽中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù);參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中水分測(cè)定儀法測(cè)定烏雞肽的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù);參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》測(cè)定烏雞肽的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù);參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法測(cè)定烏雞肽的總脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù);參照GB 31645—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》中高效分子排阻色譜法測(cè)定烏雞肽的分子質(zhì)量分布;采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定烏雞肽的氨基酸組成[15]。
1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及模型的建立
參照鄧代霞等[16]的方法構(gòu)建小鼠UC模型。55 只7 周齡C57BL/6J雄性小鼠自由飲水進(jìn)食適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,每天混勻所有墊料再分配至各籠使初期各組小鼠腸道菌群組成基本一致。然后按照體質(zhì)量分為5 組(n=11),包括正常組(CG)、模型組(MG)、柳氮黃吡啶組(PG)、烏雞肽低劑量組(LG)、烏雞肽高劑量組(HG)。正常組自由飲水,其他各組用3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)DSS溶液代替,持續(xù)14 d構(gòu)建UC模型,同時(shí)每天進(jìn)行給藥干預(yù),其中正常組和模型組灌胃生理鹽水,陽(yáng)性對(duì)照組灌胃40 mg/(kgmb·d)柳氮黃吡啶,烏雞肽低劑量和高劑量組分別灌胃100、200 mg/(kgmb·d)烏雞肽。飼養(yǎng)期間每天定時(shí)稱小鼠體質(zhì)量并觀察便血情況,同時(shí)記錄疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?,小鼠摘眼球取血后脫頸處死,迅速取出結(jié)腸及其內(nèi)容物、盲腸內(nèi)容物并量取結(jié)腸長(zhǎng)度。結(jié)腸分成3 份,一份浸泡于4%多聚甲醛中,2 份置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 小鼠體質(zhì)量變化率、結(jié)腸長(zhǎng)度測(cè)定及DAI評(píng)分
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每天灌胃前稱量小鼠體質(zhì)量,采用糞便隱血試劑盒測(cè)定便血評(píng)分,根據(jù)夏圣坤等[17]的方法計(jì)算DAI,三者得分的平均值即為小鼠最終DAI評(píng)分,具體細(xì)則如表1所示。小鼠處死后測(cè)量每只小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度。按下式計(jì)算體質(zhì)量變化率。
表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for DAI scoring
1.3.4 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察
取固定于4%多聚甲醛溶液中的結(jié)腸組織,脫水、包埋、切片,之后使用HE進(jìn)行染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察切片,分析其病理?yè)p傷情況。
1.3.5 結(jié)腸組織炎癥因子的測(cè)定
取適量結(jié)腸樣本,按照料液比1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水,勻漿離心后取上清液,根據(jù)BCA蛋白濃度試劑盒以及炎癥因子試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白含量和炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1β的含量。
1.3.6 腸道微生物組成的測(cè)定
將小鼠結(jié)腸內(nèi)容物送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序引物序列為F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’,R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’,測(cè)序區(qū)域16S_V3~V4?;谏虾E缮Z生物科技有限公司旗下派森諾基因云平臺(tái)(https://www.genescloud.cn/home)進(jìn)行生物信息分析。
1.3.7 盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量的測(cè)定
稱取300 mg解凍后的小鼠盲腸內(nèi)容物于離心管中,加入1.0 mL甲基叔丁基醚,再加入體積分?jǐn)?shù)2.0%濃鹽酸,充分碾磨、渦旋混勻,再于冰水浴中超聲5 min,最后4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液過(guò)0.22 μm濾膜,加入1%二乙基丁酸(10 mg/mL)作為內(nèi)標(biāo),于棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)。
氣相色譜分析條件:DB-FFAD 色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);程序升溫參數(shù)為:起始溫度60 ℃,保持5 min后以10 ℃/min升溫至160 ℃,維持2 min,最后以20 ℃/min升溫至220 ℃,維持5 min;進(jìn)樣口溫度為220 ℃,進(jìn)樣體積為1.2 μL,載氣為氮?dú)?,吹掃流?.0 mL/min,分流比為10∶1;火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector,F(xiàn)ID)溫度為250 ℃,尾氣為氮?dú)猓矚饬髁繛?0 mL/min,氫氣流量為35 mL/min,空氣流量400 mL/min[18]。
采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,除微生物數(shù)據(jù)每組5 個(gè)平行外,其余數(shù)據(jù)每組8 個(gè)平行,數(shù)據(jù)間的顯著性采用Tukey單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA),顯著水平為P<0.05,采用Origin 2019軟件作圖。
烏雞肽中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(80.06±0.44)%,水分、灰分和粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(3.72±0.67)%、(9.03±0.53)%和(13.00±0.71)%。由圖1可知,烏雞肽主要由5 種不同分子質(zhì)量的多肽片段組成,191~321、321~787、787~1 849、1 849~3 167 Da和3 167~7 967 Da的多肽相對(duì)含量分別為6.66%、34.76%、31.56%、13.07%和9.05%,其中3 200 Da以下的多肽占86.05%。由表2可知,共從烏雞肽樣品中鑒定出17 種氨基酸,其中必需氨基酸7 種,相對(duì)含量為23.77%;疏水性氨基酸7 種,相對(duì)含量為27.02%;帶正電氨基酸3 種,相對(duì)含量為14.07%。氨基酸組成、殘基類型以及疏水性均對(duì)多肽的生物活性有一定的影響,在肽段中帶正電荷的氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸)以及疏水性氨基酸對(duì)抗炎活性均具有促進(jìn)作用[19]。
圖1 烏雞肽分子質(zhì)量分布Fig.1 Molecular mass distribution of G.gallus domesticlus Brisson peptides
表2 烏雞肽的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of G.gallus domesticlus Brisson peptides
結(jié)腸炎小鼠的常規(guī)癥狀主要表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、腹瀉、腸道出血、結(jié)腸縮短以及黏膜潰瘍等[4]。由圖2A可知,各組的平均初始體質(zhì)量沒有顯著差異,正常組小鼠的體質(zhì)量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間呈逐漸上升趨勢(shì),而模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、烏雞肽低劑量組和高劑量組小鼠的體質(zhì)量從第6天開始明顯降低,且逐漸有便血情況出現(xiàn)。第14天時(shí),正常組小鼠的體質(zhì)量變化率為(110.61±2.59)%,而模型組小鼠的體質(zhì)量降低至初始體質(zhì)量的(78.54±5.75)%;烏雞肽干預(yù)后,與模型組相比,烏雞肽低劑量組和高劑量組小鼠體質(zhì)量均有所增加,分別增加至初始體質(zhì)量的(90.16±2.93)%和(92.03±2.54)%,說(shuō)明烏雞肽具有一定的緩解結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕的效果。
圖2 烏雞肽對(duì)結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量(A)和DAI評(píng)分(B)的影響(n=8)Fig.2 Effects of G.gallus domesticlus Brisson peptides on the body mass (A) and disease activity index score (B) of UC mice (n=8)
DAI評(píng)分常用于評(píng)估DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度[20]。如圖2B所示,第14天時(shí)模型組的DAI評(píng)分(2.59±0.17)高度顯著高于正常組(0.33±0.00)(P<0.001),通過(guò)體質(zhì)量和DAI評(píng)分結(jié)果可判定模型構(gòu)建成功。烏雞肽干預(yù)12 d后,烏雞肽干預(yù)組小鼠的DAI評(píng)分高度顯著低于模型組(P<0.001),至第14天,烏雞肽低劑量組、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間沒有明顯差異。因此,烏雞肽在緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕、腹瀉和便血方面顯示出潛在的保護(hù)作用,這與Yang Wenting等[7]使用大米蛋白肽干預(yù)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的效果一致。明珠等[21]使用腸道炎癥臨床治療藥物柳氮磺吡啶對(duì)UC模型小鼠進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)柳氮磺吡啶處理組結(jié)腸炎小鼠的體質(zhì)量更趨近正常小鼠,本研究中柳氮磺吡啶干預(yù)后結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕得到緩解的結(jié)果與之一致。
結(jié)腸縮短是DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥的另一顯著特征。如圖3A、B所示,與正常組相比,模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度((5.40±0.50)cm)顯著縮短了3.09 cm(P<0.05),采用烏雞肽干預(yù)后,低劑量組與高劑量組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度分別恢復(fù)到(6.72±0.56)cm和(7.00±0.41)cm,均顯著高于模型組(P<0.05),此外也發(fā)現(xiàn)烏雞肽干預(yù)后小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度同樣高于陽(yáng)性對(duì)照((6.38±0.47)cm)。綜上,補(bǔ)充烏雞肽緩解了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎結(jié)腸縮短和腸道疾病癥狀。這可能與烏雞肽中存在的疏水氨基酸有關(guān),疏水氨基酸可以增強(qiáng)細(xì)胞膜與多肽之間的相互作用,有利于生物活性肽參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)節(jié),從而達(dá)到抗炎效果[19]。
圖3 小鼠結(jié)腸圖片(A)、結(jié)腸長(zhǎng)度(B)和結(jié)腸組織HE染色(200×)(C)(n=8)Fig.3 Mouse colon photographs (A),colon length (B),and HE stained colon tissue (200 ×) (C) (n=8)
采用HE染色對(duì)結(jié)腸組織切片進(jìn)行病理學(xué)觀察,如圖3C所示,正常組小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,可以觀察到完整的上皮和隱窩,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)極少,黏膜層腸腺豐富,黏膜下層未出現(xiàn)病理?yè)p傷。模型組小鼠的結(jié)腸組織出現(xiàn)黏膜上皮和腸腺結(jié)構(gòu)缺失和黏膜下水腫,黏膜和黏膜下層出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。烏雞肽和柳氮磺吡啶干預(yù)后結(jié)腸損傷情況有所改善,主要表現(xiàn)為隱窩縮短減輕、黏膜損傷減輕以及黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少,表明烏雞肽干預(yù)可減輕腸炎小鼠的結(jié)腸損傷程度。Li Lingyu等[4]發(fā)現(xiàn)皮蛋蛋白可以減少結(jié)腸黏膜損傷、緩解隱窩縮短以及減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),從而改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷,并且其可以通過(guò)抑制核因子κB p65(nuclear factor-kappa B p65,NF-κB p65)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)蛋白磷酸化,抑制促炎細(xì)胞因子的分泌和基因表達(dá)。
炎癥的發(fā)生和加重是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,與巨噬細(xì)胞的病原體活化密切相關(guān),活化的巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子,其中TNF-α和IL(IL-6、IL-1β)等被認(rèn)為是引發(fā)炎癥的關(guān)鍵因子,IL-10是一種具有抗炎特性的細(xì)胞因子[7]。因此,本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定結(jié)腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的表達(dá),結(jié)果如圖4A~D所示。與正常組相比,DSS處理顯著增加了小鼠結(jié)腸組織中促炎因子TNF-α((216.46±22.38)pg/mg pro)和IL-6((29.64±1.80)pg/mg pro)(P<0.05)的含量,使IL-1β的含量((19.37±1.95)pg/mg pro)有所上升,并使IL-10的含量((168.49±31.96)pg/mg pro)有所下降,但無(wú)顯著變化(P>0.05)。與模型組相比,烏雞肽低劑量組和高劑量組小鼠結(jié)腸中TNF-α和IL-6含量均顯著降低(P<0.05),其中TNF-α含量分別降低至(166.66±23.98)pg/mg pro和(156.88±19.83)pg/mg pro,IL-6含量分別降低至(22.71±3.47)pg/mg pro和(23.39±3.74)pg/mg pro。與模型組相比,烏雞肽低劑量組((13.24±1.51)pg/mg pro)和陽(yáng)性對(duì)照組中IL-1β含量顯著降低(P<0.05),而高劑量組((15.05±2.66)pg/mg pro)與之無(wú)顯著差異(P>0.05)。另外,烏雞肽處理組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量與陽(yáng)性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明,烏雞肽可通過(guò)抑制促炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生而起到抗炎作用。有研究發(fā)現(xiàn)大豆生物活性肽同樣具有抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β分泌的作用,從而降低結(jié)腸炎癥水平[19]。
圖4 小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的含量(n=8)Fig.4 Contents of inflammatory factors in mouse colon tissue (n=8)
2.5.1 腸道微生物多樣性
由表3可知,各組小鼠的Coverage指數(shù)均大于0.99,表明樣本覆蓋率高,可以反映腸道微生物的真實(shí)情況。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用于評(píng)價(jià)腸道微生物的多樣性,Shannon指數(shù)越大,表示多樣性越高,Simpson指數(shù)則相反[20]。由表3可知,與模型組相比,烏雞肽干預(yù)的結(jié)腸炎小鼠Shannon指數(shù)升高(P>0.05),而高劑量組的Simpson指數(shù)下降(P>0.05),說(shuō)明烏雞肽干預(yù)可增加DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道微生物多樣性。
表3 小鼠腸道微生物多樣性變化(n=5)Table 3 Changes of intestinal microbial diversity in mice (n=5)
2.5.2 門水平腸道微生物豐度變化
如圖5A所示,機(jī)體中98%的腸道菌群是由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacterota)組成。在正常組中,小鼠腸道微生物主要由Bacteroidetes(52.17%)、Firmicutes(40.92%)、Verrucomicrobia(5.62%)3 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門組成。模型組中Proteobacteria、Verrucomicrobia的相對(duì)豐度有所增加,Bacteroidetes的相對(duì)豐度降低,其中Proteobacteria的相對(duì)豐度增加最顯著,從正常組的0.47%增加到了33.73%。研究發(fā)現(xiàn),Proteobacteria是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志物,Proteobacteria相對(duì)豐度的異常增加會(huì)使得缺乏Toll樣受體-5(Toll-like receptor 5,TLR-5)的小鼠出現(xiàn)自發(fā)性的結(jié)腸炎和菌群失調(diào)癥狀,從而出現(xiàn)結(jié)腸黏膜層紊亂[22]。與模型組相比,烏雞肽的干預(yù)可增加Verrucomicrobia的相對(duì)豐度,降低Proteobacteria的相對(duì)豐度,這與Li Lingyu等[4]用蛋清干預(yù)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎腸道微生物的變化一致。
圖5 小鼠腸道微生物差異分析(n=5)Fig.5 Analysis of intestinal microflora differences in mice (n=5)
2.5.3 屬水平腸道微生物豐度變化
結(jié)腸炎常伴隨致病菌豐度的增加和有益菌豐度的減少,志賀菌(Shigella)是常見的食源性病原菌,可引起結(jié)腸水腫、潰瘍等一系列癥狀;Clostridiaceae是條件致病菌,被認(rèn)為是引起腹瀉和結(jié)腸炎的主要原因之一[23];瘤胃球菌(Ruminococcus)和顫螺菌(Oscillospira)分別是屬于毛螺菌科和瘤胃菌科潛在的益生菌,與腸道炎癥息息相關(guān),其代謝產(chǎn)物乙酸或丁酸可以抑制腸道炎癥[24-25];阿克曼菌(Akkermansia)是一種常見的腸道共生菌,在修復(fù)黏膜上皮、緩解炎癥反應(yīng)以及改善自身免疫中發(fā)揮積極作用[26]。
如圖5B、D~H所示,各組小鼠腸道微生物的相對(duì)豐度在屬水平上存在差異。與正常組比,模型組小鼠Akkermansia、Shigella和Clostridiaceae_Clostridium的相對(duì)豐度分別升高了2.82、30.95 個(gè)百分點(diǎn)和2.33 個(gè)百分點(diǎn),Oscillospira的相對(duì)豐度下降了0.67 個(gè)百分點(diǎn),說(shuō)明DSS導(dǎo)致小鼠腸道微生物有益菌和有害菌相對(duì)豐度失調(diào)。Mo Jianling等[20]發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的小鼠Escherichia_Shigella的豐度顯著升高。通過(guò)烏雞肽干預(yù),低劑量和高劑量組的有益菌Akkermansia、Ruminococcus和Oscillospira的相對(duì)豐度高于模型組,其中Akkermansia相對(duì)豐度分別升高了2.72、4.49 個(gè)百分點(diǎn)、Ruminococcus相對(duì)豐度分別升高了0.20、10.78 個(gè)百分點(diǎn)、Oscillospira相對(duì)豐度分別升高了1.65、0.85 個(gè)百分點(diǎn),但低劑量組Ruminococcus相對(duì)豐度與模型組無(wú)顯著差異(P>0.05)。通過(guò)烏雞肽干預(yù),有害菌Shigella和Clostridiaceae的相對(duì)豐度得到了有效控制,烏雞肽低劑量組和高劑量組Shigella的相對(duì)豐度分別比模型組降低了29.26、27.04 個(gè)百分點(diǎn),Clostridiaceae相對(duì)分度分別比模型組降低了1.10、2.52 個(gè)百分點(diǎn),表明烏雞肽可以通過(guò)減少有害菌的相對(duì)豐度、增加有益菌的相對(duì)豐度緩解結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥狀。有研究發(fā)現(xiàn)桑葚花青素可通過(guò)降低有害菌Escherichia_Shigella、上調(diào)潛在有益細(xì)菌Akkermansia的相對(duì)豐度來(lái)調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的結(jié)構(gòu),從而增強(qiáng)腸道屏障功能[20]。
2.5.4 腸道微生物屬水平熱圖分析
通過(guò)屬水平群落組分相似度的物種組成熱圖統(tǒng)計(jì)分析(圖5C)可以看出,正常組、模型組和烏雞肽干預(yù)組小鼠的腸道微生物結(jié)構(gòu)之間存在明顯差異。同時(shí),根據(jù)進(jìn)化關(guān)系及顏色變化可發(fā)現(xiàn),烏雞肽低劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組小鼠的腸道菌群相對(duì)豐度與正常組具有明顯差異,烏雞肽高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)更相似,進(jìn)一步證明烏雞肽可以改變結(jié)腸炎小鼠腸道微生物的相對(duì)豐度。
短鏈脂肪酸是腸道微生物的代謝產(chǎn)物,是促進(jìn)宿主與腸道微生物之間建立互利關(guān)系的關(guān)鍵因素,可參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)腸道消化吸收、保持腸道屏障完整等,與腸道疾病密切相關(guān)。腸道中的短鏈脂肪酸主要由乙酸、丙酸以及丁酸組成,而丁酸鹽被多次證明是腸上皮細(xì)胞維持腸道屏障的必需能量來(lái)源,丁酸含量的降低會(huì)破環(huán)腸道屏障,增加腸道炎癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[27-28]。
如表4所示,模型組盲腸內(nèi)容物中總短鏈脂肪酸含量顯著低于正常組(P<0.05),其中乙酸、丙酸和丁酸含量降低最為明顯,從正常組的(1.04±0.06)、(0.42±0.07)、(2.73±0.13)mg/g分別下降至(0.39±0.04)、(0.16±0.02)、(0.45±0.08)mg/g。Monk等[29]報(bào)道,短鏈脂肪酸特別是丁酸能夠通過(guò)下調(diào)炎癥信號(hào)通路表達(dá)、減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及增強(qiáng)腸道屏障完整性而發(fā)揮抗炎作用,灌腸短鏈脂肪酸可作為結(jié)腸炎的有效治療方法。與模型組相比,灌胃烏雞肽后,低劑量組和高劑量組中總短鏈脂肪酸含量顯著增加(P<0.05),其中高劑量組中乙酸、丙酸和丁酸含量增加最為明顯,分別增加至(1.21±0.12)、(0.44±0.08)、(1.33±0.15)mg/g,表明灌胃烏雞肽可以通過(guò)增加短鏈脂肪酸的含量緩解結(jié)腸炎癥水平,這可能與腸道中Akkermansia、Ruminococcus的相對(duì)豐度增加有關(guān)[4,26]。
表4 小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量(n=5)Table 4 Short-chain fatty acid contents in cecal contents of mice (n=5)mg/g
本實(shí)驗(yàn)研究了烏雞肽對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,DSS處理后小鼠體質(zhì)量減輕、DAI評(píng)分增加、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短,結(jié)腸組織中促炎因子分泌增加,腸道黏膜和腸道上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損。與模型組相比,烏雞肽灌胃干預(yù)后,小鼠體質(zhì)量明顯增加,DAI評(píng)分下降,結(jié)腸長(zhǎng)度更趨近于正常小鼠,并且結(jié)腸上皮細(xì)胞固有層和隱窩受損情況得以改善,結(jié)腸中促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)量降低。16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),烏雞肽干預(yù)可通過(guò)降低有害菌Shigella、Clostridiaceae_Clostridium的相對(duì)豐度,增加有益菌Akkermansia、Ruminococcus、Oscillospira的相對(duì)豐度,減輕結(jié)腸炎小鼠的疾病癥狀。另外,與正常組相比,小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)后,總短鏈脂肪酸、乙酸、丙酸和丁酸含量顯著降低,而經(jīng)過(guò)烏雞肽干預(yù)后,盲腸內(nèi)容物中總短鏈脂肪酸、乙酸、丙酸和丁酸含量較模型組顯著升高,且高劑量的烏雞肽效果更明顯。因此,烏雞肽可通過(guò)緩解結(jié)腸長(zhǎng)度縮短、DAI評(píng)分增加、結(jié)腸組織損傷、抑制促炎因子產(chǎn)生、改變小鼠腸道微生物的組成以及改變腸道微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的組成,達(dá)到緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠UC的效果。