張皓月, 侯 嬌, 楊相政, 李 健, 曾凱芳, 姚世響,*

(1.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院/國家柑桔工程技術(shù)研究中心/川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400715;2.中華全國供銷合作總社 濟(jì)南果品研究所, 山東 濟(jì)南 250204;3.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 北京 100048)

枯水是柑橘果實(shí)常見的生理性病害,主要發(fā)生于采前成熟階段或采后貯藏階段[1]。大部分柑橘栽培品種均有枯水發(fā)生的報(bào)道,如三紅蜜柚和琯溪蜜柚等柚類[2-3]、豐臍和倫晚臍橙等甜橙類[4-5]、椪柑和沙糖桔等寬皮柑橘類[6-7]、尤力克(Eureka)和里斯本(Lisbon)等檸檬類[8]、黃果柑和大雅柑等雜柑類[9-10],以及胡柚和葡萄柚等[1,11]。柑橘枯水后,果實(shí)糖酸風(fēng)味寡淡,嚴(yán)重時喪失食用品質(zhì)和商品價值。柑橘果實(shí)枯水時,汁胞呈高度異質(zhì)化狀態(tài),?；臀s是主要的2種類型[1]。汁胞枯水類型與柑橘品種有一定關(guān)系,比如柚類通常以?；癁橹?寬皮柑橘和甜橙則?；臀s均比較常見[1]。?；逝虼笥不硇?萎縮汁胞呈萎縮塌陷表型,2種汁胞具有相似的糖酸風(fēng)味寡淡表型。

相關(guān)學(xué)者在揭示汁胞枯水時糖酸快速消耗機(jī)制方面做了大量工作。張百超等[12]提出“果皮過度衰老誘導(dǎo)枯水”假說,果皮過度衰老導(dǎo)致汁胞糖酸急劇消耗和枯水。陳昆松等[13]提出“果皮相對再生長誘導(dǎo)枯水”假說,果皮相對再生長誘發(fā)汁胞糖酸耗竭和枯水。這2種假說均有一定的生理數(shù)據(jù)支撐,同時這2種假說相互存在矛盾,這反映了柑橘枯水這一生理性病害高度復(fù)雜的特點(diǎn)。Huang等[1,4,6,14-15]基于汁胞的大量生理證據(jù)提出“細(xì)胞壁代謝紊亂誘導(dǎo)枯水”假說,果膠代謝紊亂和細(xì)胞壁物質(zhì)大量合成誘導(dǎo)汁胞糖酸物質(zhì)耗竭和枯水,該假說為柑橘枯水的分子機(jī)制研究提供了概念性基礎(chǔ)[1,11,16]。此外,汁胞枯水時有機(jī)酸(主要組分為檸檬酸)的急劇消耗更為顯著,其降解途徑也開始被闡明[3]。其中,柑橘果實(shí)成熟時檸檬酸降解有2條主要途徑——乙酰輔酶A合成途徑和GABA支路,第1條途徑在枯水時被顯著激活[3]。目前枯水進(jìn)程中糖酸消耗機(jī)制的研究主要是在?；椭羞M(jìn)行的,對萎縮型汁胞關(guān)注較少。

塔羅科血橙(Citrussinensiscv. Tarocco)在我國主要栽培于三峽庫區(qū)(萬州等地),是晚熟柑橘的重要品種,在1月底至2月中旬成熟,通過留樹保鮮技術(shù)延長至3～5月上市,在冬季極端低溫的年份易發(fā)生采前枯水[17]。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),塔羅科血橙枯水時汁胞呈萎縮狀態(tài),是典型的萎縮型枯水。近期研究揭示血橙汁胞萎縮型枯水進(jìn)程中,果膠代謝紊亂和木質(zhì)素合成途徑激活是柑橘枯水的主要誘因,為本研究分析汁胞檸檬酸消耗機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[14-15]。本研究以塔羅科血橙為實(shí)驗(yàn)材料,采用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析汁胞枯水時初生代謝物質(zhì)的變化,進(jìn)一步綜合運(yùn)用生理、生物信息學(xué)和基因分析技術(shù)對枯水時檸檬酸消耗的機(jī)制進(jìn)行解析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

塔羅科血橙(C.sinensiscv. Tarocco)果實(shí)采于2021年4月中旬重慶三峽庫區(qū)的柑橘果園,當(dāng)天運(yùn)回位于重慶市西南大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室,選擇成熟度和大小一致的果實(shí)(約200個)用于實(shí)驗(yàn),正常汁胞和枯水汁胞分別取自正常和枯水血橙果實(shí),用液氮速凍后,-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

次氯酸鈉,分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;甲醇、乙腈,色譜純,美國Merck公司;磺基水楊酸,分析純,北京索萊寶生物科技公司;PBS溶液(磷酸鹽緩沖液),分析純,重慶躍翔化工有限公司。

BC0915谷氨酰胺合酶(glutamine synthetase,GLN)活性檢測試劑盒,北京索萊寶生物科技公司;BS-E18788O2植物谷氨酰胺脫羧酶(glutamine decarboxylase,GAD)ELISA試劑盒,江蘇博深生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-100F型凍干機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;MM400型研磨儀,德國Retsch公司;TGL-18MS型冷凍離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Nexera X2型系列超高效液相色譜儀,日本島津公司;SB-C18液相色譜柱,美國Agilent公司;4500 QTRAP型串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國Applied Biosystems公司;L-8900型全自動氨基酸分析儀,日本日立公司;SYNERGY H1型多功能酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1代謝組學(xué)樣本制備及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

參考Zhu等[18]的方法進(jìn)行代謝組學(xué)樣品制備及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析。將汁胞樣本用凍干機(jī)冷凍干燥,使用研磨儀充分研磨(30 Hz,1.5 min)成粉末;稱取100 mg粉末,溶解于體積分?jǐn)?shù)70%甲醇提取液中,振蕩30 s,每30 min振蕩1次,共振蕩6次,樣品置于4 ℃過夜提取。12 000 r/min離心10 min后,用直徑0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液,然后存于進(jìn)樣瓶中。正常汁胞樣本記為N組,枯水汁胞樣本記為VC組,質(zhì)控樣本記為mix組,3組樣本均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),用于UPLC-MS/MS分析。

液相條件:樣品進(jìn)樣量為4 μL,流速為0.35 mL/min,每個樣品分析時間約為15 min。液相色譜柱2.1 mm×100 mm×1.8 μm,柱溫40 ℃;流動相A相為水(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸),B相為乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸);洗脫梯度為0 min時B相體積比例為5%,在9 min內(nèi)B相體積比例線性增加至95%,并在95%維持1 min,然后在1.1 min內(nèi)B相比例降至5%,并在5%維持3 min。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源溫度為550 ℃;離子噴霧電壓分別為5 500 V(正離子模式)和4 500 V(負(fù)離子模式);離子源氣體Ⅰ壓力為344.75 kPa、離子源氣體Ⅱ壓力為413.69 kPa、氣簾氣(curtain gas)壓力為172.37 kPa;碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高;三重四極桿(triple quadrupole)掃描使用多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式。

1.3.2代謝物質(zhì)定性與定量分析

將二級質(zhì)譜信息與MWDB數(shù)據(jù)庫信息比對鑒定代謝物質(zhì);用MRM模式進(jìn)行代謝物質(zhì)定量分析。使用軟件Analyst 1.6.3處理獲得的樣本質(zhì)譜分析數(shù)據(jù),對物質(zhì)質(zhì)譜峰進(jìn)行峰面積積分,并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜峰進(jìn)行積分校正。代謝組數(shù)據(jù)使用MetaX進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis),VIP(variable important in projection)≥1、fold change ≥2(或≤0.5)和P<0.05作為代謝物質(zhì)含量具有顯著性差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3氨基酸定量分析

氨基酸定量分析參考Wang等[3]的方法并略有修改。稱取0.5 g汁胞粉末,加入1.5 mL體積分?jǐn)?shù)為6%磺基水楊酸,40 kHz超聲提取30 min;4 ℃,12 000 r/min離心15 min,收集上清液后用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)過濾,用全自動氨基酸分析儀測定氨基酸含量(ng·g-1),設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4檸檬酸降解相關(guān)酶活性測定

GLN和GAD活性分別用相應(yīng)活性檢測試劑盒測定。粗酶液分別在540 nm和450 nm處測定吸光度,酶活表示為U/mg,GLN活性設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù),GAD活性設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.5脂代謝相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析

基因的生物信息學(xué)鑒定參考Wang等[3]的方法。從TAIR11數(shù)據(jù)庫(Arabidopsis Information Resource)下載擬南芥脂代謝基因家族序列,用本地Blast軟件比對甜橙基因組(C.sinensisV1)數(shù)據(jù)庫,得到的基因序列用Pfam分析驗(yàn)證蛋白質(zhì)是否存在保守結(jié)構(gòu)域,最終鑒定甜橙的相關(guān)基因家族成員。

將甜橙脂代謝基因家族序列用TBtools軟件分析其基因家族成員的染色體定位,并根據(jù)定位及擬南芥同源基因名稱命名基因。用Expasy工具分析基因編碼蛋白的長度、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等理化特性。用基因結(jié)構(gòu)顯示工具(gene structure display server,GSDS)分析基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)信息,用Pfam軟件鑒定及顯示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

1.3.6基因轉(zhuǎn)錄水平分析

基因表達(dá)分析參考Wang等[3]的方法。提取血橙汁胞總RNA后構(gòu)建cDNA文庫,用Illumina Hiseq平臺測序。用TopHat v2.0.12軟件將測序數(shù)據(jù)比對甜橙基因組(C.sinensis),用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads)表示基因表達(dá)水平。差異基因用DESeq2 R package軟件分析(P<0.05),設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

除代謝物質(zhì)和基因表達(dá)數(shù)據(jù),其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Graphpad Prism 9.0(美國GraphPad Software公司)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用t檢驗(yàn)(P<0.05)判別顯著性差異。用Adobe Illustrator 2021軟件(美國Adobe公司)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣溫與血橙枯水相關(guān)性的觀察

柑橘采前成熟階段的氣溫是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素。以三峽庫區(qū)主要城市萬州為例,三峽庫區(qū)血橙采前階段的氣溫變化和果實(shí)枯水表型見圖1。低溫天氣在12月至次年2月出現(xiàn),部分年份甚至?xí)陀? ℃[圖1(a)]。在2020年冬季,萬州血橙果園出現(xiàn)一段時間-8～0 ℃的寒潮,次年果實(shí)出現(xiàn)大面積枯水現(xiàn)象。本研究對枯水果實(shí)進(jìn)行深入觀察后發(fā)現(xiàn),枯水汁胞呈萎縮塌陷表型,為典型的汁胞萎縮型枯水[圖1(b)]。

圖1 三峽庫區(qū)血橙采前階段的氣溫變化和果實(shí)枯水表型Fig.1 Temperature variation of blood orange preharvest in Three Gorges Reservoir area and phenotype of fruit affected by segment drying

2.2 血橙枯水時汁胞的廣泛靶向代謝組學(xué)分析結(jié)果

2.2.1樣本主成分分析及代謝物質(zhì)鑒定結(jié)果

為了判斷組間樣本總體差異和組內(nèi)樣本變異度,對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),見圖2。第一主成分PC1和第二主成分PC2的解釋率分別為62.73%和9.53%,提示正常和枯水血橙組樣本存在明顯差異[圖2(a)]。組內(nèi)樣本的皮爾遜相關(guān)系數(shù)均大于0.95,提示重復(fù)樣本間相關(guān)性強(qiáng),變異小[圖2(b)]。 這些數(shù)據(jù)表明代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)可信度高,可用于后續(xù)分析。

N表示正常汁胞樣本,VC表示枯水汁胞樣本,mix表示質(zhì)控樣本。圖2 血橙正常和枯水樣本的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of normal and segment drying samples of blood orange

廣泛靶向代謝組學(xué)從血橙汁胞中共鑒定到480種初生代謝物。這些代謝物質(zhì)可分為11類,包括110種氨基酸及其衍生物、93種有機(jī)酸、76種糖及醇類、60種游離脂肪酸、55種核苷酸及其衍生物、29種溶血磷脂酰膽堿、21種維生素、23種溶血磷脂酰乙醇胺、9種甘油酯、3種鞘脂及1種磷脂酰膽堿。

2.2.2代謝物質(zhì)的定量分析結(jié)果

代謝物質(zhì)的定量分析結(jié)果見圖3。廣泛靶向代謝組學(xué)共鑒定了193種代謝物質(zhì)在血橙枯水時差異積累[圖3(a)]。其中,165種上調(diào),28種下調(diào)。差異代謝物質(zhì)的聚類結(jié)果顯示,脂類和氨基酸等多類物質(zhì)含量在枯水時上調(diào)[圖3(b)]。將差異代謝物質(zhì)與KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫比對,用KOBAS (KEGG orthology based annotation system)分析差異代謝途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),亞油酸代謝通路是唯一的顯著富集通路(P<0.05)[圖3(c)]。進(jìn)一步對亞油酸代謝相關(guān)脂類物質(zhì)的組成及枯水時的含量變化特征進(jìn)行分析,66種脂類代謝物質(zhì)在枯水時都顯著富集,包括39種游離脂肪酸、11種溶血磷脂酰膽堿、9種溶血磷脂酰乙醇胺、6種甘油酯和1種鞘脂。這些結(jié)果表明,亞油酸代謝可能是血橙枯水時汁胞代謝物質(zhì)變化的主要特征。亞油酸合成是柑橘果實(shí)檸檬酸降解關(guān)鍵途徑——乙酰輔酶A合成途徑的主要部分,說明該途徑是血橙果實(shí)枯水時檸檬酸降解的主要途徑。

Z得分表示差異代謝物相對含量歸一化處理后的數(shù)值,反映含量的高低(紅色為高含量,綠色為低含量)。N表示正常汁胞樣本,VC表示枯水汁胞樣本。圖3 血橙汁胞枯水時的差異代謝物分析Fig.3 Differential metabolite analysis in juice vesicles of blood orange during segment drying

2.2.3檸檬酸降解途徑相關(guān)代謝物質(zhì)的含量變化

為系統(tǒng)了解血橙枯水時檸檬酸的消耗機(jī)制,本研究對代謝組學(xué)揭示的檸檬酸降解相關(guān)代謝物質(zhì)進(jìn)行了深入挖掘。血橙汁胞枯水時檸檬酸降解途徑相關(guān)代謝物質(zhì)的變化見圖4。血橙枯水時,檸檬酸含量下降了53.1%(P<0.05)[圖4(a)]。乙酰輔酶A合成途徑是通過將檸檬酸裂解生成乙酰輔酶A,再參與合成亞油酸、氨基酸及次生代謝物質(zhì)?？菟畷r,亞油酸及脂類物質(zhì)含量顯著上調(diào)(P<0.05)[圖4(b)],絲氨酸含量顯著上調(diào)(P<0.05)[圖4(c)]。結(jié)果證實(shí)乙酰輔酶A合成途徑是血橙枯水時降酸的主要途徑。

*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖4 血橙汁胞枯水時檸檬酸降解途徑相關(guān)代謝物質(zhì)變化Fig.4 Changes of metabolites relating to citric acid degradation in juice vesicles of blood orange during segment drying

異檸檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸等三羥酸(TCA)循環(huán)的中間代謝物質(zhì)在枯水時呈現(xiàn)出不一致的變化特征。其中,異檸檬酸含量下降了61%(P<0.05)[圖4(d)],α-酮戊二酸含量沒有顯著變化(P>0.05)[圖4(e)],琥珀酸含量則增加了120%(P<0.05)[圖4(f)]。這些結(jié)果表明,TCA循環(huán)在血橙枯水時發(fā)生了變化,但其活性不是簡單的增加關(guān)系。α-酮戊二酸一方面可通過生成谷氨酸,進(jìn)一步合成谷氨酰胺從而進(jìn)入氮循環(huán);另一方面也可通過生成γ-氨基丁酸(GABA),進(jìn)入GABA支路。血橙枯水時,谷氨酸和GABA含量沒有顯著變化(P>0.05)[圖4(g)至圖4(h)],說明GABA支路沒有被激活。

2.3 血橙枯水時氨基酸的變化

為全面了解氨基酸組分在枯水時的變化,判斷檸檬酸的降解途徑,本研究分析了16種常見氨基酸枯水時的變化,見圖5。其中,15種氨基酸(異亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸)在血橙枯水時含量顯著增加(P<0.05)。血橙枯水時,含量最高的前5種氨基酸分別是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸,除精氨酸沒有顯著(P>0.05)變化外,其余4種氨基酸在枯水時分別增加了101.3%、66.2%、229.7%和634.3%。天冬氨酸可以通過催化生成草酰乙酸進(jìn)一步合成檸檬酸,枯水時天冬氨酸含量的升高提示氨基酸裂解合成檸檬酸途徑的活性受抑制。乙酰輔酶A合成途徑可以將檸檬酸降解為乙酰輔酶A和草酰乙酸,乙酰輔酶A進(jìn)一步生成賴氨酸,同時草酰乙酸可以催化合成甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸,這些氨基酸的含量在枯水時均顯著增加,由此進(jìn)一步證實(shí)乙酰輔酶A合成途徑在血橙枯水時被顯著激活,是汁胞檸檬酸降解的主要途徑。

Ile:異亮氨酸;Met:蛋氨酸;Leu:亮氨酸;Cys:半胱氨酸;Gly:甘氨酸;Tyr:酪氨酸;Val:纈氨酸;Phe:苯丙氨酸;His:組氨酸;Ala:丙氨酸;Lys:賴氨酸;Thr:蘇氨酸;Ser:絲氨酸;Glu:谷氨酸;Asp:天冬氨酸;Arg:精氨酸。*表示正常和枯水汁胞的游離氨基酸含量具有顯著性差異(P<0.05)。圖5 血橙汁胞枯水時氨基酸質(zhì)量比Fig.5 Amino acid mass ratio in juice vesicles of blood orange during segment drying

2.4 血橙枯水時檸檬酸降解關(guān)鍵酶活性變化

為探討血橙枯水時檸檬酸降解途徑是否在酶活水平受調(diào)控,本研究分析了檸檬酸降解的2個關(guān)鍵酶(谷氨酰胺合酶GLN和谷氨酰胺脫羧酶GAD)活性,見圖6。其中,GLN催化谷氨酸生成谷氨酰胺,其活性在枯水時增加了75.3%(P<0.05)[圖6(a)]。表明谷氨酰胺合成途徑在酶活性水平被激活。GAD催化谷氨酸脫羧生成GABA,其活性在枯水時沒有顯著變化(P>0.05)[圖6(b)],說明GABA支路的酶活水平在枯水時沒有激活,與代謝物質(zhì)變化規(guī)律一致。

*表示正常和枯水汁胞酶活性具有顯著差異(P<0.05)。圖6 血橙汁胞枯水時檸檬酸降解關(guān)鍵酶的活性Fig.6 Key enzymes activities of citric acid degradation in juice vesicles of blood orange during segment drying

2.5 血橙枯水時檸檬酸降解途徑相關(guān)基因表達(dá)分析

綜合代謝組學(xué)、氨基酸定量分析及GLN、GAD酶活數(shù)據(jù),乙酰輔酶A合成途徑是血橙枯水時檸檬酸降解的主要途徑。

2.5.1脂代謝相關(guān)基因在甜橙中的生物信息學(xué)鑒定結(jié)果

脂代謝是本研究代謝組學(xué)揭示的枯水時相關(guān)主要差異代謝途徑,是檸檬酸通過乙酰輔酶A合成途徑降解后的重要去向。乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACCase)作用下催化生成丙二酰輔酶A,硬脂酰-ACP去飽和酶(stearyl-ACP desaturase,FAB)催化硬脂酸生成油酸,然后油酸被脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase,FAD)催化成亞油酸和α-亞麻酸,最后由脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)催化合成13-氫過氧化亞麻酸。甜橙脂代謝相關(guān)基因的生物信息學(xué)鑒定與分析見圖7。生物信息學(xué)方法從甜橙基因組鑒定了2個編碼ACCase的基因(命名為CsaccA和CsaccC)、6個編碼FAB的基因(命名為CsFAB1～6)、8個編碼FAD的基因(命名為CsFAD1～8)和12個編碼LOX的基因(命名為CsLOX1～12)。這些基因分布在8條染色體上,包括chr1、3、4、6、7、8、9及Un[圖7(a)]。對脂代謝基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析,見表1。由表1可知,6個CsFAB編碼的蛋白質(zhì)包含322～396個氨基酸,8個CsFAD編碼的蛋白質(zhì)包含306～447個氨基酸,12個CsLOX編碼的蛋白質(zhì)包含603～932個氨基酸。

表1 脂代謝基因編碼蛋白的基本特性

圖7 甜橙脂代謝相關(guān)基因的生物信息學(xué)鑒定與分析Fig.7 Identification and analysis of bioinformatics of lipid metabolism related genes in sweet orange

甜橙脂代謝相關(guān)基因的基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖7(b)、圖7(c)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同一基因家族內(nèi)不同成員的外顯子數(shù)量有明顯差異[圖7(b)]。CsaccA和CsaccC分別有16個和10個外顯子;除CsFAB4含有2個外顯子外,其余CsFABs均有3個外顯子;CsFAD1～2和CsFAD6～8沒有內(nèi)含子,CsFAD3含有7個外顯子,CsFAD4有10個外顯子,CsFAD5有8個外顯子;對于CsLOX家族,CsLOX8有5個外顯子,其余成員則含有8～9個外顯子[圖7(b)]。甜橙脂代謝基因家族編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示,同一家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域高度保守[圖7(c)]。

2.5.2脂代謝基因在血橙枯水時的表達(dá)規(guī)律分析

血橙汁胞枯水時脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)見圖8。 28個脂代謝基因的19個成員在血橙汁胞中有表達(dá)(FPKM>1),包括2個CsACCase、5個CsLOX、7個CsFAD和5個CsFAB。其中,CsaccA在枯水時表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)[圖8(a)];CsLOX家族有4個基因差異表達(dá),表達(dá)量變化最大的成員為CsLOX2,在枯水時上調(diào)了206.4%,另外,CsLOX1在枯水時表達(dá)量增加了179%(P<0.05)[圖8(b)];CsFAB家族中,共有3個枯水差異表達(dá)基因,其中CsFAB2和CsFAB6在枯水時表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)[圖8(c)];共有7個CsFAD家族成員在枯水時差異表達(dá),其中CsFAD1～6顯著上調(diào)(P<0.05)。盡管有部分CsLOX、CsFAD和CsFAB家族成員在枯水時下調(diào),但脂代謝基因家族在枯水時整體呈上調(diào)趨勢,提示脂代謝的轉(zhuǎn)錄被激活。

*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖8 血橙汁胞枯水時脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)Fig.8 Expression of genes related to lipid metabolism in juice vesicles of blood orange during segment drying

2.5.3其他檸檬酸代謝相關(guān)基因在血橙枯水時的表達(dá)規(guī)律分析

血橙汁胞枯水時檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)見圖9。柑橘果實(shí)檸檬酸合成主要包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AAT)和檸檬酸合成酶(citrate synthase,CS)2個關(guān)鍵酶;其中豐度最高的CsAATs成員Cs4g16050在枯水時表達(dá)量降低了47.9%(P<0.05)[圖9(a)];2個CsCSs成員在血橙枯水時表達(dá)均沒有顯著差異(P>0.05)[圖9(b)]。綜合CsAATs和CsCSs家族成員在枯水時的表達(dá)量可以判斷,血橙枯水時檸檬酸合成途徑的轉(zhuǎn)錄整體呈被抑制的狀態(tài)。

*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖9 血橙汁胞枯水時檸檬酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)Fig.9 Expression of genes related to citric acid metabolism in juice vesicles of blood orange during segment drying

谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、谷氨酰胺合酶(glutamine synthetase,GLN)、谷氨酸合酶(glutamate synthase,GLT)和谷氨酰胺脫羧酶(glutamine decarboxylase,GAD)是柑橘果實(shí)檸檬酸降解途徑中的4個關(guān)鍵酶。CsGDHs家族成員共2個差異表達(dá)基因均在枯水時顯著上調(diào)(P<0.05)[圖9(c)];2個CsGLTs家族成員在枯水時均顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)[圖9(d)];CsGLNs在枯水時無顯著變化(P>0.05)[圖9(e)]。這些結(jié)果提示谷氨酸合成途徑在枯水時被激活,這也可能是汁胞谷氨酸含量增加的原因。2個CsGADs家族成員在枯水時均顯著下調(diào)(P<0.05)[圖9(f)],CsGABA-AT在枯水沒有顯著變化(P>0.05)[圖9(g)]。這說明GABA途徑的轉(zhuǎn)錄在枯水時被抑制。乙酰輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶——ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)編碼基因CsACLs家族共有3個成員,在枯水時沒有顯著的差異表達(dá)(P>0.05)[圖9(h)]。推測ACL的調(diào)控可能主要不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,有待于進(jìn)一步深入研究。

3 討 論

檸檬酸是柑橘果實(shí)的主要有機(jī)酸,在成熟和衰老階段緩慢降解,而在枯水時則快速降解[1,19-21]。檸檬酸耗竭是柑橘枯水的典型特征,本研究發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A途徑在血橙汁胞萎縮型枯水時被激活,而GABA支路活性在枯水時相對穩(wěn)定。

乙酰輔酶A合成途徑是柑橘果實(shí)成熟和衰老時檸檬酸消耗的主要途徑[20-21]。檸檬酸經(jīng)ACL催化降解為草酰乙酸和乙酰輔酶A,其中乙酰輔酶A進(jìn)一步進(jìn)入氨基酸、脂肪酸和次生代謝物合成等途徑[20]。本研究的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)(包括代謝物質(zhì)變化及代謝途徑變化規(guī)律)和氨基酸含量結(jié)果提供了強(qiáng)有力的證據(jù),支持乙酰輔酶A合成途徑是血橙汁胞萎縮型枯水時檸檬酸降解的主要機(jī)制。轉(zhuǎn)錄水平的證據(jù)提示,盡管乙酰輔酶A合成途徑關(guān)鍵酶ACL的表達(dá)在枯水時沒有被激活,但脂代謝相關(guān)基因整體呈上調(diào)趨勢。Wang等[3]對蜜柚汁胞?；涂菟奶撬岽x進(jìn)行了系統(tǒng)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A合成途徑是其檸檬酸降解的主要途徑。在椪柑中也發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A合成途徑是其枯水時檸檬酸降解的主要機(jī)制[6]。可以推測,乙酰輔酶A合成途徑是汁胞萎縮型和?；涂菟卸即嬖诘谋Ｊ亟邓嵬緩?。

目前對柑橘果實(shí)乙酰輔酶A合成途徑的轉(zhuǎn)錄水平等調(diào)控機(jī)制研究較少。本研究揭示該途徑關(guān)鍵酶ACL在轉(zhuǎn)錄過程中沒有被激活,暗示枯水時存在其他水平的調(diào)控機(jī)制。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果揭示,ACL在轉(zhuǎn)錄后特別是翻譯后表達(dá)被調(diào)控[22-23],這進(jìn)一步證實(shí)了本研究的猜想。在粒化型枯水中,蜜柚編碼ACL的基因CgACL表達(dá)量顯著上調(diào)[3],椪柑中也有類似的結(jié)果[6]。這說明乙酰輔酶A合成途徑的調(diào)控機(jī)制或許在2種枯水類型中不同,2種枯水類型在形態(tài)及生理方面存在差異,需要進(jìn)一步深入研究。

GABA支路是近年被發(fā)現(xiàn)的柑橘檸檬酸降解途徑,主要發(fā)生在果實(shí)成熟和衰老階段[24-25]。本研究的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)、酶活數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄水平證據(jù)均表明,GABA支路在枯水時沒有被激活,甚至可能被抑制。這意味著GABA支路不是血橙枯水時檸檬酸快速降解的主要途徑。該結(jié)果與蜜柚?；涂菟械慕Y(jié)果一致[3],說明在2種枯水類型中,GABA支路都不是主要的降酸途徑。檸檬酸降解內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制還不清楚,但考慮到柑橘枯水時,細(xì)胞壁合成途徑的異常激活同樣也導(dǎo)致檸檬酸的快速消耗,研究推測細(xì)胞壁代謝途徑和GABA支路可能存在某種拮抗關(guān)系,有待未來深入研究。

4 結(jié) 論

本研究以塔羅科血橙為實(shí)驗(yàn)材料,研究了汁胞萎縮型枯水的檸檬酸降解機(jī)制。結(jié)果表明:血橙在采前遭遇低溫時易發(fā)生汁胞萎縮型枯水,枯水汁胞中的檸檬酸含量顯著下降,絲氨酸、亞油酸及其他脂類物質(zhì)等乙酰輔酶A途徑代謝產(chǎn)物的含量顯著升高,同時脂代謝基因在枯水時呈上調(diào)表達(dá)趨勢,編碼ACL的基因CsACLs的表達(dá)沒有明顯變化。GABA含量和GAD活性在枯水時變化不明顯,編碼GAD的基因CsGADs的表達(dá)呈下調(diào)趨勢。GLN活性在血橙枯水進(jìn)程中顯著升高。結(jié)果表明,血橙枯水時檸檬酸快速降解的主要機(jī)制是乙酰輔酶A合成途徑,而不是GABA支路,此外,谷氨酰胺合成及TCA循環(huán)可能也參與血橙枯水時檸檬酸降解。本研究揭示了柑橘萎縮型枯水進(jìn)程中檸檬酸降解機(jī)制,對于理解柑橘枯水的生理基礎(chǔ)具有一定的意義。