黃志遠(yuǎn), 董文明, 田 洋, 黃艾祥, 王雪峰

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 云南 昆明 650201)

近年來,食品安全已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點問題。微生物污染是最常見的食品安全問題之一,可引起食品腐敗和食源性疾病,從而影響人類的健康,并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種革蘭氏陽性共生細(xì)菌[2],作為世界上第三大食源性致病菌,可引起菌血癥、敗血癥等疾病[3],在中國超過25%的食源性疾病都與S.aureus有關(guān)[4]。而導(dǎo)致感染的毒力因子受細(xì)菌生長階段的調(diào)控,細(xì)菌在早期對數(shù)期時會產(chǎn)生細(xì)胞因子,這些因子使細(xì)菌能夠逃避宿主的防御并建立生物膜[5]。生物膜是一種具有良好結(jié)構(gòu)和多樣性的動態(tài)細(xì)菌胞外聚集物,對抗生素的耐藥性是原菌株的10～1 000倍[6]。因此,有必要尋找新型抑制劑進(jìn)一步抵抗細(xì)菌生物膜的形成。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一類具有天然生物活性的多肽,對細(xì)菌、病毒、真菌都有抑制作用[7]。它們是生物體(如兩棲動物、哺乳動物、昆蟲和植物)用來對抗病原體入侵的天然免疫屏障,被稱為“第二防御系統(tǒng)”[8]。與傳統(tǒng)抗生素不同,AMPs具有多靶點的抑菌機(jī)制,一些AMPs可以通過破壞細(xì)胞壁膜、作用于DNA和RNA、抑制蛋白質(zhì)合成以及增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平來發(fā)揮作用,因此不易產(chǎn)生耐藥性[9]。并且AMPs對環(huán)境友好,具有良好的穩(wěn)定性,可以在食品工業(yè)中作為一種新型食品防腐劑保存原料與產(chǎn)品[10]。同時,有研究表明,一些AMPs可以有效抑制生物膜的形成,甚至對成熟的生物膜造成破壞[11]。如來自舌蘭蛙的抗菌肽brevin-gr23可顯著抑制胞外多糖的產(chǎn)生、金黃色葡萄球菌生物膜的附著和形成[12]。螺旋肽G3可以在不同階段干擾變形鏈球菌生物膜的形成,在初始階段,G3通過降低細(xì)菌表面電荷、疏水性、膜完整性和黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄來抑制細(xì)菌黏附;在后期,G3與胞外聚合物中的胞外DNA(eDNA)相互作用,破壞成熟生物膜的3D穩(wěn)定性結(jié)構(gòu),從而分散它們[13]。

MOp2和MOp3是本課題組前期從辣木籽蛋白水解物中分離鑒定到的2種新型陰離子抗菌肽。MOp2相對分子質(zhì)量為907.06,MOp3相對分子質(zhì)量為712.81,都帶1個負(fù)電荷,固體狀態(tài)下結(jié)構(gòu)以β-轉(zhuǎn)角為主,具有良好的穩(wěn)定性,使用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理1 h后仍保留70%以上的活性。它們對S.aureus表現(xiàn)出了良好的抑菌活性,并且對S.aureus造成一定的膜損傷[14-15]。但MOp2、MOp3是否會對S.aureus的生物膜產(chǎn)生抑制作用鮮有研究。因此,本研究擬通過分析MOp2、MOp3對S.aureus生物膜的形成能力以及成熟生物膜的影響,結(jié)合分子對接技術(shù)解析2種辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S.aureus(CICC 10384),中國工業(yè)培養(yǎng)收集中心。結(jié)晶紫(分析純)、DAPI熒光染料(分析純),中國碧云天生物技術(shù)有限公司;刃天青(分析純),中國索萊寶科技有限公司。MOp2(肽序列:HVLDTPLL)、MOp3(肽序列:HVLDTPLL),肽段純度98%以上,安徽省國平藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan Go型酶標(biāo)儀,美國Thermo Scientific公司;Dmi3000B型熒光顯微鏡,德國Carl Zeiss AG公司;DHp-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱,北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;TGL20M型臺式高速離心機(jī),北京中興偉業(yè)儀器有限公司;LDZM-60KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1S.aureus生物膜形成能力測定

參照Ommen等[16]方法并稍加修改。在24孔板中分別加入2 mL無菌胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(TSB)和體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL),在37 ℃下分別培養(yǎng)4、8、12、24、48、72、96、120 h。培養(yǎng)完成后,棄去培養(yǎng)基,并用PBS清洗以除去浮游細(xì)菌。然后向各孔添加500 μL甲醇,固定1 h后棄去甲醇并用PBS洗滌。向各孔加入體積分?jǐn)?shù)1%結(jié)晶紫染色15 min后用PBS洗滌。干燥后,加入200 μL乙醇-丙酮溶液(體積比4∶1),然后在595 nm處測定吸光度。

1.3.2辣木籽抗菌肽處理后S.aureus最小抑制生物膜質(zhì)量濃度和最小清除生物膜質(zhì)量濃度測定

參照Zhang等[17]方法并稍加修改。最小抑制生物膜質(zhì)量濃度(MBIC)測定:在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB和體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL),隨后加入抗菌肽,使之終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL,37 ℃培養(yǎng)48 h以形成生物膜。然后在每孔中加入噻唑藍(lán)(MTT)溶液20 μL(5 mg/mL),2 h后吸去上清液,用PBS清洗以除去游離菌,乙醇脫色后測定OD570 nm。以無菌TSB孔為空白對照組,OD值與空白組相比無顯著變化的最小質(zhì)量濃度定為MBIC。最小清除生物膜質(zhì)量濃度(MBEC)測定:生物膜在24孔板中培養(yǎng)完成后,用PBS洗去游離菌,加入與測定MBIC相同質(zhì)量濃度的抗菌肽,然后在37 ℃下培養(yǎng)24 h。MTT染色后測定OD570 nm,OD值與對照組相比無明顯變化的最小質(zhì)量濃度定為MBEC。

1.3.3辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜的清除作用測定

參照Ommen等[16]方法并稍加修改。在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB和體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL)。37 ℃培養(yǎng)48 h以形成生物膜,隨后棄去TSB并使用無菌PBS清洗,然后加入MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水,在37 ℃下培養(yǎng)12 h。在0、2、4、6、8、10、12 h時,參照1.3.1節(jié)中結(jié)晶紫染色法測定各組樣品的OD595 nm。

1.3.4辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜微觀形態(tài)的變化

參照Lin等[18]方法并稍加修改。在6孔板中分別加入5 mL無菌TSB、體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL)及1片無菌蓋玻片(2 cm×2 cm)。37 ℃培養(yǎng)48 h以形成生物膜,隨后棄去TSB并使用無菌PBS清洗,然后加入MOp2與MOp3(4 mg/mL),空白對照組中加入無菌水。37 ℃培養(yǎng)12 h后,取出蓋玻片,并加入DAPI(10 μg/mL)在黑暗中染色20 min,隨后用熒光顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)。

1.3.5辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜內(nèi)細(xì)菌新陳代謝的變化

將不銹鋼片(1 cm×1 cm)在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡24 h,并超聲處理1 h以除去表面雜質(zhì)。隨后用無菌去離子水徹底清洗,并將不銹鋼片121 ℃高壓滅菌30 min備用。在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB、體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL)及1片滅菌不銹鋼片。37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成生物膜,隨后棄去TSB并用無菌PBS清洗,然后加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水。處理4 h,取出不銹鋼片置于無菌均質(zhì)袋,加入10 mL PBS超聲15 min,使生物膜細(xì)菌從不銹鋼片上分離并收集菌懸液,在菌懸液中加入體積分?jǐn)?shù)10%的刃天青溶液,37 ℃黑暗中振蕩2 h,4 ℃下10 000 r/min離心10 min取得上清液,用酶標(biāo)儀分別檢測其在560 nm激發(fā)波長和590 nm發(fā)射波長處的熒光值。

1.3.6辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜初期形成的變化

1.3.6.1 細(xì)菌初期黏附實驗

參照Bai等[19]方法并稍加修改。體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL)接種于含3 mL葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)、氯化鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%)的腦心浸液培養(yǎng)基中,并加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水,在37 ℃下培養(yǎng)至對數(shù)期。以5 000 r/min冷凍離心5 min,得細(xì)菌沉淀物,將細(xì)菌沉淀物置于37 ℃下,并加到含纖維蛋白原的96孔板中,孵育1 h后,用體積分?jǐn)?shù)25%的甲醛固定,然后進(jìn)行結(jié)晶紫染色,用酶標(biāo)儀測定OD595 nm。相對黏附率計算見式(1)。

(1)

1.3.6.2 辣木籽抗菌肽處理后S.aureus表面疏水性的變化

體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL)接種于3 mL的TSB肉湯,并加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白對照組中加入無菌水,在37 ℃下培養(yǎng)24 h。之后向試管中加入500 μL甲苯,劇烈旋轉(zhuǎn)3 min,然后靜止10 min,以獲得相分離。最后,仔細(xì)吸取下層水相,并在渦流前后測定600 nm處吸光度。疏水率計算見式(2)。

(2)

1.3.7辣木籽抗菌肽處理后S.aureus生物膜胞外聚合物的變化

1.3.7.1 酶解實驗

在48孔板中分別加入2 mL無菌TSB和體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL)。37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成生物膜,培養(yǎng)后棄掉培養(yǎng)基。實驗共設(shè)置4組樣品,其中1組為空白組,其余3組為實驗組,每組設(shè)置10個復(fù)孔?？瞻捉M中加入無菌水,實驗組分別加入高碘酸鈉(10 μmol/L)、脫氧核糖核酸酶(2 mg/mL)和蛋白酶K(100 μg/mL)。將48孔板在37 ℃培養(yǎng)2 h,并用結(jié)晶紫染色。乙醇脫色30 min后,用酶標(biāo)儀測定595 nm處的吸光度。

1.3.7.2 細(xì)菌胞外多糖含量測定

參照崔海英等[20]方法并稍加修改。將不銹鋼片(1 cm×1 cm)在體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇中浸泡24 h,并超聲處理1 h以除去表面雜質(zhì)。隨后用無菌去離子水徹底清洗,并將不銹鋼片在121 ℃下高壓滅菌30 min備用。在24孔板中分別加入2 mL無菌TSB、體積分?jǐn)?shù)1%的細(xì)菌菌懸液(108CFU/mL)及1片滅菌的不銹鋼片。37 ℃下培養(yǎng)48 h以形成生物膜,培養(yǎng)開始時加入抗菌肽MOp2與MOp3(2、4、8 mg/mL),空白組加入等量無菌水。培養(yǎng)完成后,棄去TSB,并用PBS沖洗以除去表面游離菌。將清洗后的不銹鋼片置于PBS中超聲處理1 h,收集菌懸液,10 000 r/min離心10 min取上清液作為胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)樣本備用。

采用苯酚-硫酸法測定上清液中胞外多糖的含量,將1 mL上清液和1 mL苯酚(50 g/L)溶液混合,混合均勻后振蕩30 s,之后加入15 mL硫酸(體積分?jǐn)?shù)95%)溶液,在黑暗中反應(yīng)15 min后,將溶液渦旋振蕩10 s,置于恒溫水浴中反應(yīng)20 min。使用紫外分光光度計檢測溶液在490 nm處的吸光度,以分析胞外多糖的質(zhì)量濃度。

1.3.7.3 細(xì)菌胞外蛋白含量測定

使用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒測定樣品蛋白質(zhì)含量。取1.3.7.2節(jié)中制備的EPS樣本40 μL于試管中,按照蛋白質(zhì)加樣量(表1)加樣,靜置10 min,用酶標(biāo)儀在波長595 nm處測定各管的吸光度,按式(3)計算蛋白質(zhì)含量。

表1 蛋白質(zhì)加樣量

(3)

1.3.7.4 細(xì)菌eDNA含量測定

按照1.3.7.2節(jié)中方法制備EPS樣本,使用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取EPS中eDNA后,使用酶標(biāo)儀檢測260 nm處的吸光度,并根據(jù)吸光度計算eDNA含量。

1.3.8分子對接分析

對接使用的AgrA、LuxS、CshA、SarA蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)從Uniprot數(shù)據(jù)庫中下載獲得,其中AgrA蛋白的PDB ID為6PRA,其余蛋白質(zhì)為基于Alphafold預(yù)測的結(jié)構(gòu)。MOp2、MOp3的3D結(jié)構(gòu)采用PyMol 2.5.2構(gòu)建,并保存為PDB格式。

采用AutoDock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行分子對接,在對接開始之前,使用PyMol 2.5.2對受體蛋白進(jìn)行處理,包括去除水分子、鹽離子以及小分子。隨后設(shè)置對接盒子,使之包裹整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。此外,使用ADFRsuite 1.03將所有處理好的小分子以及受體蛋白轉(zhuǎn)換為AutoDock Vina 1.1.2對接必需的PDBQT格式。對接時,全局搜索的詳盡度設(shè)為32,其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。打分最高的對接構(gòu)象被認(rèn)為是結(jié)合構(gòu)象,最后使用PyMol 2.5.2對接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果使用SPSS 26.0軟件分析,采用單因素方差分析和Bonferroni統(tǒng)計學(xué)檢驗來確定P<0.05的顯著性水平下的統(tǒng)計差異,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 S. aureus生物膜的形成能力

S.aureus可以在食品原料或者食品加工機(jī)器表面形成生物膜。金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力見圖1。由圖1可知,隨著培養(yǎng)時間的延長,吸光度不斷上升,并且在48 h達(dá)到最高(1.78),表明此菌株有很強(qiáng)的生物膜形成能力,其結(jié)果判讀依據(jù)是OD595 nm>4ODc(ODc=0.08)為強(qiáng)生物膜形成株[21]。48 h時被認(rèn)為是生物膜的成熟階段,生物膜復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)完全形成,生物膜內(nèi)細(xì)菌群也處于活躍狀態(tài)[22-23]。因此,在后續(xù)的實驗中,生物膜培養(yǎng)時間選擇為48 h。

圖1 金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力Fig.1 Biofilm forming ability of S. aureus

2.2 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜的MBIC和MBEC測定結(jié)果

辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MBIC和MBEC見圖2。由圖2可知,MOp2、MOp3對S.aureus的MBIC均為4 mg/mL,MBEC均為8 mg/mL。MOp2與MOp3的MBIC處于成熟生物膜抑制劑桉葉素(8 mg/mL)[24]與丁香精油(1 mg/mL)[17]之間,因此,MOp2、MOp3有望成為一種新型生物膜抑制劑。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖2 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌的MBIC和MBECFig.2 MBIC and MBEC of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on S.aureus

2.3 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜的清除作用

MOp2、MOp3對S.aureus生物膜的清除效果采用結(jié)晶紫半定量法測定,結(jié)果見圖3。空白組的吸光度在12 h內(nèi)基本保持不變,實驗組的吸光度隨著MOp2、MOp3質(zhì)量濃度的增加而減少,說明MOp2與MOp3的質(zhì)量濃度越高對S.aureus生物膜的清除效果越好。1×MBIC的MOp2處理12 h后,生物膜清除率達(dá)到63.28%,2×MBIC時生物膜清除率達(dá)到80.56%。1×MBIC的MOp3處理12 h后,生物膜清除率達(dá)到67.90%,2×MBIC時生物膜清除率達(dá)到81.64%,進(jìn)一步說明MOp2、MOp3可以有效清除生物膜且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

圖3 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜的清除效果Fig.3 Clearance effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on S. aureus biofilm

2.4 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜微觀形態(tài)的影響

為了研究MOp2、MOp3對S.aureus生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,采用熒光顯微鏡對菌體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了微觀觀察,見圖4。由圖4可知,空白組[圖4(a)]生物膜結(jié)構(gòu)完整、立體,處理組[圖4(b)至圖4(e)]熒光強(qiáng)度明顯下降,生物膜三維結(jié)構(gòu)解體,大多呈游離狀態(tài)分散在玻片表面。結(jié)果表明:MOp2、MOp3能破壞S.aureus的生物膜立體結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)菌死亡,這與Reis-Teixeira等[25]的研究結(jié)果一致。

圖4 金黃色葡萄球菌生物膜經(jīng)辣木籽抗菌肽處理前后的熒光顯微照片F(xiàn)ig.4 Fluorescence micrographs of S. aureus biofilm before and after treatment with Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides

2.5 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜內(nèi)細(xì)菌新陳代謝的影響

細(xì)菌的新陳代謝能力一定程度上能反映出菌體細(xì)胞的活力。刃天青具有熒光強(qiáng)度,能夠穿透細(xì)胞膜,通過不同細(xì)菌氧化還原酶的作用降解為高熒光強(qiáng)度的中間產(chǎn)物試鹵靈。刃天青向試鹵靈轉(zhuǎn)化是不可逆的,并且這種轉(zhuǎn)化與參與代謝的細(xì)菌數(shù)量成正比,因此這種方法可以檢測細(xì)菌的生存能力[26]。

MOp2、MOp3對金黃色葡萄球菌生物膜新陳代謝的影響見圖5。由圖5可知,經(jīng)過0.5×MBIC的MOp2與MOp3處理后,S.aureus生物膜的代謝活性明顯下降(P<0.05),分別下降了15.60%和20.62%;而經(jīng)過1×MBIC的MOp2與MOp3處理后,S.aureus生物膜的代謝活性顯著下降了54.11%和62.34%。造成S.aureus生物膜代謝活性下降的原因可能是細(xì)菌代謝過程中能量傳遞的電子傳遞鏈主要位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面,細(xì)胞膜在受到抗菌肽的刺激和破壞后,能量代謝功能紊亂,因此代謝活性大大下降,同時先前的研究通過冷凍掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)MOp2、MOp3可以破壞S.aureus的細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)[14-15]。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖5 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜新陳代謝的影響Fig.5 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on biofilm metabolism of S. aureus

2.6 辣木籽抗菌肽對S. aureus生物膜黏附率的影響

生物膜初期形成階段主要依靠細(xì)菌細(xì)胞之間的黏附作用聚集到一起,此時細(xì)菌利用細(xì)胞壁錨定蛋白(CWA)附著于不同載體的表面[27]。本研究測定了MOp2、MOp3對S.aureus初期黏附的影響,見圖6。 由圖6可知,0.5×MBIC的MOp2與MOp3可以顯著抑制S.aureus的初始定值(P<0.05),黏附率分別下降了19.84%和24.04%;1×MBIC的MOp2與MOp3對S.aureus的黏附呈現(xiàn)了更好的抑制作用,黏附率分別下降了44.19%和50.77%;特別是在2×MBIC時,黏附率分別下降了74.45%和75.96%。結(jié)果表明:MOp2、MOp3對生物膜菌體的初期黏附能力具有抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴性,細(xì)菌初期黏附能力下降,生物膜的形成能力也隨之下降。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖6 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜黏附率的影響Fig.6 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on biofilm adsorption of S. aureus

2.7 辣木籽抗菌肽對S. aureus表面疏水性的影響

細(xì)胞表面疏水性與細(xì)菌黏附、生物膜的形成密切相關(guān),細(xì)菌表面疏水性的降低可能會弱化生物膜的形成能力[28]。MOp2與MOp3對S.aureus表面疏水性的影響見圖7。由圖7可知,與空白組相比,在經(jīng)過MOp2與MOp3處理后,細(xì)菌表面疏水性均有顯著下降(P<0.05),且與抗菌肽質(zhì)量濃度呈正相關(guān);在2×MBIC時,S.aureus的表面疏水性分別下降了71.94%和73.77%,這與楊露等[28]的研究結(jié)果一致。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖7 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜疏水性的影響Fig.7 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on biofilm hydrophobicity of S. aureus

2.8 辣木籽抗菌肽對S. aureus胞外聚合物的影響

2.8.1S.aureus生物膜組成分析

成熟的生物膜是附著的微生物群落,能夠抵抗外來分子(包括許多小分子抗菌劑)并導(dǎo)致持續(xù)感染[29]。生物膜的形成首先是細(xì)菌黏附到表面,然后是群體感應(yīng)(QS)的聚集、菌落發(fā)育和EPS的分泌。其中,EPS具有一系列的功能,如作為支架和將生物膜細(xì)胞連接在一起[30]。同時,EPS還為生物膜提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,并維持了其代謝活性。使用高碘酸鈉、DNaseⅠ和蛋白酶分別水解多糖、DNA和蛋白質(zhì),測定胞外多糖、eDNA和胞外蛋白的含量,發(fā)現(xiàn)S.aureus生物膜中含量最高的是蛋白質(zhì)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)49.01%),其次是胞外多糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)39.73%)和eDNA(質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.26%)。

2.8.2辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜胞外多糖的影響

多糖是EPS中研究最多的成分,基于糖單體,多糖分為同多糖和雜多糖。EPS的含量在增長平穩(wěn)期開始時處于峰值,在指數(shù)階段和穩(wěn)定階段觀察到QS活性,QS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子影響胞外多糖操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,并控制胞外多糖的產(chǎn)生[31]。MOp2與MOp3對細(xì)菌胞外多糖含量的影響見圖8。在經(jīng)過1×MBIC的MOp2與MOp3處理后,胞外多糖的含量出現(xiàn)顯著下降(P<0.05),分別下降了22.66%和27.39%;2×MBIC時,胞外多糖含量下降更為明顯?？赡艿脑蚴荕Op2與MOp3對S.aureus的QS系統(tǒng)造成影響,使胞外多糖合成受阻。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖8 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜胞外多糖的影響Fig.8 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on extracellular polysaccharides of S. aureus biofilm

2.8.3辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜胞外蛋白的影響

S.aureus的胞外聚合物中含量最高的為蛋白質(zhì),并且有研究對生物膜的EPS基質(zhì)進(jìn)行蛋白組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)存在一些毒力因子,它們是感染宿主的主要蛋白質(zhì)[32],因此,探究MOp2與MOp3對細(xì)菌胞外蛋白分泌的影響尤為重要。辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜胞外蛋白的影響見圖9。經(jīng)過1×MIBC的MOp2、MOp3作用后,胞外蛋白的含量分別下降了48.05%和39.55%;經(jīng)過2×MIBC的MOp2、MOp3作用后,胞外蛋白的含量分別下降了61.57%和54.54%。這說明MOp2與MOp3在很大程度上阻止了胞外蛋白的形成,并且明顯抑制了胞外蛋白的合成與分泌,這與Vazquez-Armenta等[33]的研究結(jié)果一致。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖9 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜胞外蛋白的影響Fig.9 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on extracellular protein of S. aureus biofilm

2.8.4辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜胞外DNA的影響

eDNA是S.aureus生物膜的功能成分,起初eDNA被認(rèn)為是一種次要成分,主要與基因轉(zhuǎn)移的基因庫有關(guān),但是最近有研究重新評估了其對生物膜形成的貢獻(xiàn)。eDNA通過細(xì)胞死亡和裂解釋放,主要發(fā)生在生物膜的內(nèi)部,保護(hù)細(xì)菌免受抗菌劑和抗生素的影響[34],此外,eDNA還能促進(jìn)細(xì)胞間的細(xì)胞黏附[35]。MOp2與MOp3對eDNA的影響見圖10。 在0.5×MBIC與1×MBIC時,生物膜eDNA的含量變化不顯著,在2×MBIC時,eDNA含量明顯下降(P<0.05),分別下降了為14.24%和17.55%,與Secchi等[36]的研究結(jié)果一致,說明MOp2與MOp3通過抑制eDNA的合成,破壞細(xì)菌的自我防御系統(tǒng)并導(dǎo)致生物膜無法黏附。

不同小寫字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖10 辣木籽抗菌肽對金黃色葡萄球菌生物膜eDNA的影響Fig.10 Effect of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides on eDNA of S. aureus biofilm

2.9 辣木籽抗菌肽與S. aureus生物膜形成關(guān)鍵蛋白的分子對接分析

QS系統(tǒng)在生物膜形成過程中起關(guān)鍵作用。QS系統(tǒng)中的AgrA蛋白對菌體生物膜的形成、毒力因子分泌等多種生物活性起調(diào)控作用[37]。CshA是一種細(xì)菌黏附蛋白,覆蓋在細(xì)菌細(xì)胞表面,細(xì)菌可以利用其附著在基質(zhì)或者其他細(xì)菌上形成生物膜[38]。QS系統(tǒng)中AI-2信號分子的合成依賴LuxS蛋白酶。LuxS蛋白酶可以影響細(xì)菌形成生物膜以及其耐藥性[39]。葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)因子(SarA)是重要的毒力基因調(diào)控因子,可調(diào)控約120個基因的表達(dá),涉及QS系統(tǒng)、生物膜合成、耐藥性等眾多與S.aureus致病相關(guān)的生理過程[40]。這4種蛋白質(zhì)在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用,使用分子對接技術(shù)可推測MOp2、MOp3是否與這4種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。

結(jié)合能表示對接的可能性,低于-20.92 kJ/mol通常被認(rèn)為更有可能結(jié)合[41]。辣木籽抗菌肽與S.aureus生物膜形成關(guān)鍵蛋白的分子對接位點見表2。由表2可知,MOp2、MOp3與這4種蛋白的結(jié)合能均小于-20.92 kJ/mol。辣木籽抗菌肽與S.aureus生物膜形成關(guān)鍵蛋白的分子對接結(jié)果見圖11。 由圖11可知,MOp2通過3個氫鍵與AgrA結(jié)合,MOp3通過6個氫鍵與AgrA結(jié)合;MOp2通過3個氫鍵與CshA結(jié)合,MOp3通過6個氫鍵與CshA結(jié)合;MOp2通過6個氫鍵與LuxS結(jié)合,MOp3通過6個氫鍵與LuxS結(jié)合;MOp2通過2個氫鍵與SarA結(jié)合,MOp3通過4個氫鍵與SarA結(jié)合。結(jié)果表明:MOp2與MOp3均可能通過氫鍵與這4種蛋白質(zhì)結(jié)合,從而抑制這些蛋白質(zhì)的表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)菌無法黏附和形成生物膜。

圖11 辣木籽抗菌肽與金黃色葡萄球菌生物膜形成關(guān)鍵蛋白的分子對接結(jié)果Fig.11 Molecular docking results of Moringa oleifera seeds antimicrobial peptides with key biofilm formation proteins of S. aureus

表2 辣木籽抗菌肽與金黃色葡萄球菌生物膜形成關(guān)鍵蛋白的分子對接分析

3 結(jié) 論

本研究采用結(jié)晶紫半定量法證明了S.aureusCICC 10384有很強(qiáng)的生物膜形成能力,而辣木籽抗菌肽MOp2、MOp3對S.aureus生物膜的MBIC和MBEC均為4 mg/mL和8 mg/mL,能有效清除S.aureus生物膜。經(jīng)MOp2、MOp3處理后,S.aureus生物膜黏附減少、細(xì)菌數(shù)量減少,生物膜菌體新陳代謝能力和生物膜早期形成能力顯著下降,細(xì)菌初期黏附能力及表面疏水性降低。酶解實驗結(jié)果表明,S.aureus生物膜EPS中含量最多的為胞外蛋白,其次為胞外多糖和eDNA,而MOp2、MOp3會抑制EPS中3種成分的分泌合成。分子對接結(jié)果發(fā)現(xiàn),MOp2、MOp3均可能通過氫鍵與生物膜形成關(guān)鍵蛋白AgrA、CshA、LuxS和SarA結(jié)合,這可能導(dǎo)致群體感應(yīng)系統(tǒng)紊亂,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌無法黏附和形成生物膜。研究結(jié)果可為辣木籽抗菌肽對S.aureus生物膜的影響提供一定的參考,希望為其在食品工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。接下來的研究將通過蛋白質(zhì)組學(xué)、Western blot、平行反應(yīng)監(jiān)測、RT-qPCR等技術(shù)針對性地分析2種肽抑制生物膜的具體靶點。