閔芳芳，袁璐，丁若雯

（1. 江西省檢驗檢測認證總院檢測認證技術(shù)發(fā)展研究院，江西南昌，330052；2. 江西省藥品檢查員中心，江西南昌，330000）

0 引言

除蟲菊素是由除蟲菊花中分離萃取的具有殺蟲效果的活性成分，它包括除蟲菊素I（pyrethrins Ⅰ）、除蟲菊素II（pyrethrins II）、瓜葉菊素I（cinerinⅠ）、瓜葉菊素II（cinerin II）、茉酮菊素I（jasmolin I）、茉酮菊素II（jasmolin I），其中除蟲菊素I和除蟲菊素II為其主要成分。由于除蟲菊素具有高效、廣譜、低殘留、對人畜低毒等特點，因此被廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生殺蟲領(lǐng)域［1，2］。隨著人們對食品安全的重視，食品中除蟲菊素的殘留問題正逐漸引起關(guān)注，如我國新版的《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中除蟲菊素的品類新增了水果枸杞（鮮）、調(diào)味料（葉類調(diào)味料）及藥用植物枸杞（干）。

關(guān)于除蟲菊素的檢測分析，郝佳偉等人通過利用固體分散劑凈化的方式對黃芪樣品進行前處理用HPLCMS/MS實現(xiàn)對除蟲菊素I和除蟲菊素II進行檢測［3］。還有文獻報道，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法無需樣品凈化步驟亦可對蔬菜中除蟲菊素I和除蟲菊素II進行檢測［4］。同時，秦信先利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜建立起了除蟲菊素6個組分在傳統(tǒng)中藥材枸杞上的分析方法［5］。目前，可以檢索到的關(guān)于谷物中的除蟲菊素的檢測方法多參照（GB/T 20769—2008），該方法需經(jīng)過固相凈化柱子凈化，操作煩瑣，同時洗脫液中含有甲苯，具有致突變性及致畸性等毒性。因此，建立一種簡單、高效、準確的檢測谷物中除蟲菊素檢測方法成為迫切需求。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) （HPLC-MS/MS） 具有分離效果好、靈敏度高、抗干擾能力強、選擇性好等優(yōu)點，目前已成為農(nóng)殘檢測的首選方法［6-8］。本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)， 建立了谷物樣品中除蟲菊素I和除蟲菊素II的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6470B高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；多管渦旋混合儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；TDL離心機，上海安亭科學儀器廠；渦旋儀， 德國IKA公司。

乙腈和甲醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；PSA（分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；Si（分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；除蟲菊素I標準品（1000 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）；除蟲菊素II標準品（100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司）。

1.2 標準溶液的配置

移取1.0 mL除蟲菊素I和除蟲菊素II標準品溶液，分別置于100 mL和10 mL棕色容量瓶中， 用乙腈定容，配制成10.0 μg/mL標準儲備液。

取適量除蟲菊素I和除蟲菊素II的標準儲備液，用乙腈配置成質(zhì)量濃度為1μg/L、5μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L、1000μg/L的系列標準工作液。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取約5 g（精確至0.0001 g）樣品于50 mL離心管，加入10mL乙腈，于2500 Hz下渦旋混5min充分提取，4500 rmp下離心5 min。取2 mL上清液于10 mL離心管（含50 mg PSA+50 mg Si）中，渦旋混合2 min，于4500 rmp下離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜供分析備用。

1.3.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：Agilent Poroshell 120 EC-C18（ 50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫： 30℃；進樣量： 2 μL；流動相：乙腈（ A） 和0.1%甲酸水（ B） ， 液相條件見表1。

表1 除蟲菊I和除蟲菊素II素液相條件

質(zhì)譜條件：掃描方式為正離子掃描，檢測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：45 psi；鞘氣溫度：350℃；毛細管電壓： 3500 V；電子倍增管電壓： 500 V；除蟲菊素I和除蟲菊素II的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 除蟲菊素I和除蟲菊素II的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

本實驗考察了甲醇/乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，對除蟲菊素I和除蟲菊素II的峰形及離子化效率的影響。結(jié)果表明，用乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，除蟲菊素I和除蟲菊素II的離子化率更高、峰型更窄、對稱性更好，且靈敏度更高。因此，本實驗選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在正離子模式下，分別用質(zhì)量濃度為1000 μg/L 的除蟲菊素I和除蟲菊素II的標準溶液進行全掃描確定母離子；在SIM模式下，對透鏡補償電壓進行優(yōu)化；在Product Ion模式下，選取質(zhì)量數(shù)大、豐度強、干擾少的為定性離子和定量離子；最后，在MRM模式下，對碰撞能進行優(yōu)化。除蟲菊素I和除蟲菊素II的一級和二級質(zhì)譜圖如圖1。

圖1 除蟲菊素I和除蟲菊素II的一級和二級質(zhì)譜圖

2.2 樣品前處理優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

除蟲菊素I和除蟲菊素II均不溶于水，易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑，因此，本實驗分別向陰性大米和小麥中添加質(zhì)量濃度為0.1 mg/kg除蟲菊素I和除蟲菊素II來考察甲醇和乙腈作為提取劑對目標化合物的提取率的影響。結(jié)果如表3所示，乙腈作為提取劑，大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率均在92%以上，同時，相對于甲醇來說，大米和小麥中的除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率都更高。因此，本研究選擇乙腈作為大米和小麥中的除蟲菊素提取溶劑。

表3 不同提取劑對大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取效率的影響（n=3）

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

PSA主要去除極性干擾物，如有機酸、色素和糖類雜質(zhì)；Si主要去除如糖類等極性較大的雜質(zhì)。由于大米和小麥中主要成分為淀粉，因此，本研究通過分別添加0.1 mg/kg到陰性大米和小麥中來考察PSA、Si以及PSA和Si對大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率的影響，不同凈化劑對待測物的提取率如圖2所示。結(jié)果表明：在大米和小麥中，用PSA和Si組合比單一的PSA或單一的Si對除蟲菊素I和除蟲菊素II有更高的提取率，因此，本實驗選取50 mg PSA和50 mg Si組合的分散吸附劑作為最終的凈化劑。

圖2 不同固相分散劑對大米和小麥中除蟲菊素I和除蟲菊素II的提取率的影響（n=3）

2.3 方法驗證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

本實驗分別配置大米和小麥作為基質(zhì)的標準曲線及純?nèi)軇┡渲脴藴是€，按照公式（1）計算基質(zhì)效應(yīng)。純?nèi)軇┡渲贸x菊素I和除蟲菊素II標準曲線的斜率分別為221.97和107.39；用大米作為基質(zhì)配置除蟲菊素I和除蟲菊素II標準曲線的斜率分別為207.97和100.80；用小麥作為基質(zhì)配置除蟲菊素I和除蟲菊素II標準曲線的斜率分別為192.00和91.53。結(jié)果表明，大米作為基質(zhì)對除蟲菊素I和除蟲菊素II的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.94和0.94；小麥作為基質(zhì)對除蟲菊素I和除蟲菊素II的基質(zhì)效應(yīng)分別為0.86和0.85。一般來說，基質(zhì)效應(yīng)＜0.85表現(xiàn)為基質(zhì)抑制；基質(zhì)效應(yīng)＞1.15，表現(xiàn)為基質(zhì)增強；0.85≤基質(zhì)效應(yīng)≤1.15，基質(zhì)效應(yīng)可以忽略［9］?；谏鲜鼋Y(jié)果，本實驗可以選用純?nèi)軇┡渲贸x菊素I和除蟲菊素II的標準曲線。

2.3.2 線性范圍和檢出限

將除蟲菊素I和除蟲菊素Ⅱ的標準使用液配制成標準工作液，得到該兩種物質(zhì)在大米和小麥的標準曲線和相關(guān)系數(shù)（見表4）。結(jié)果表明，除蟲菊素I和除蟲菊素II在質(zhì)量濃度為1～1000 μg/L時，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表4 除蟲菊素I和除蟲菊素II的線性方程

2.3.3 精密度和精密度

由表5可知，在添加質(zhì)量分數(shù)為0.04～0.40 mg/kg范圍內(nèi)，除蟲菊素I在大米和小麥的回收率分別為91.22%～93.25%和89.21%～90.56%，相對標準偏差分別為0.59%～3.29%和1.19%～2.90%；除蟲菊素II在大米和小麥的回收率分別為90.33%～91.41%和88.32%～89.76%，相對標準偏差分別為1.16%～5.06%和2.98%～4.22%。符合農(nóng)藥殘留分析要求［10］。依據(jù)GB/T 20769—2018，除蟲菊素的檢測檢出限為88.16 μg/kg，而本方法中除蟲菊在此濃度的信噪比（S/N）均大于3，本方法滿足要求，因此設(shè)定檢出限為88.16 μg/kg。

表5 不同質(zhì)量濃度水平除蟲菊素I和除蟲菊素II的回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

本研究基于高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一個簡便、快速、高效地測定谷物中除蟲菊素的分析方法。該方法靈敏度高，線性關(guān)系、準確度和精密度均滿足方法學指標，可為谷物中除蟲菊素殘留的快速檢測提供技術(shù)手段。