申子平，倪海星※，陳星，趙慧敏，原慧斌

（1.長治職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 長治 046000；2.四川恒通動物制藥有限公司，四川 內(nèi)江 641000）

沙門氏菌為豬體內(nèi)的常在菌，當外界環(huán)境突變或豬體免疫力降低時就會引起發(fā)病[1]。大多養(yǎng)豬場養(yǎng)殖密度較大，造成了近幾年晉東南地區(qū)養(yǎng)豬場豬沙門氏菌病的頻繁發(fā)生。許多養(yǎng)殖場在不知沙門氏菌血清型的情況下，亂用、濫用抗菌藥物，造成沙門氏菌耐藥性增強，防治效果不理想[2]。針對這種情況，試驗先確定晉東南地區(qū)豬沙門氏菌的血清型，然后找到治療豬沙門氏菌病的敏感藥物，為該地區(qū)豬沙門氏菌病的防治提供參考。

1 材料

1.1 病料

在晉東南地區(qū)陵川、長治、長子、黎城、沁縣、襄垣、平順、武鄉(xiāng)、沁源和壺關(guān)等10 多個縣的養(yǎng)豬場采集疑似沙門氏菌病的樣品63 份，即用滅菌棉簽從病豬肛門處的直腸內(nèi)挑取大約1 g 的糞便，置于有緩沖蛋白胨水的離心管內(nèi)。離心管放置于有冰袋的保溫箱內(nèi)，密閉保存。

1.2 試劑

顯色培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；緩沖蛋白胨水、營養(yǎng)瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基由環(huán)凱微生物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)；革蘭氏染色液由常德比克曼生物科技有限公司生產(chǎn)；沙門氏菌屬定型血清由天潤生物（寧波）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；藥敏紙片、生化鑒定管由溫州布康泰生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器

恒溫培養(yǎng)箱由景邁儀器有限公司生產(chǎn)；微量移液器由力辰儀器科技公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋由杭州瑞誠儀器有限公司生產(chǎn)；電子天平由力辰（上海）儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 病菌的分離、培養(yǎng)

將樣品拭子置于亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)20～24 h；將增菌液混勻后，用移液器吸取100 μL，置于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，涂勻，37 ℃培養(yǎng)20～24 h；用接種棒挑取顯色為紫色的單菌落于營養(yǎng)瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)20～24 h；純化后，保存于4 ℃冰箱中，備用。

2.2 病菌生化試驗

挑取分離純化后的菌落，按照生化鑒定的操作流程進行生化反應(yīng)試驗[3]。生化試驗項目有18 個：三糖鐵、甘露醇、蔗糖、氰化鉀、鳥氨酸脫羧酶、麥芽糖、吲哚、尿素、丙二酸鹽、山梨醇、鼠李糖、肌醇、脲酶、酚紅、ONPG、靛基質(zhì)試驗、賴氨酸脫羧酶、葡萄糖等。

2.3 病菌血清型測定

2.3.1 病菌的O 抗原測定

對生化反應(yīng)后，確定是沙門氏菌的菌株進行血清型鑒定。取一無菌載玻片，用接種針挑取純化好的沙門氏菌單個菌落于玻片的左右兩個區(qū)域，滴加1 滴多價診斷血清于其中的一側(cè)沙門氏菌上，另一側(cè)沙門氏菌滴加1 滴生理鹽水，作為對照[4]?；靹蚝螅o置1 min，觀察結(jié)果。

有凝集反應(yīng)者，再用單因子診斷血清重復(fù)以上的操作，如果有凝集便可確定該菌株的O 抗原為此單因子抗原。

2.3.2 病菌的H 抗原測定

操作步驟同2.3.1。

根據(jù)生化反應(yīng)與病菌O 抗原測定與H 抗原測定結(jié)果，確定測試株的血清型。

2.4 分離菌致病性試驗

選取18～20 g 的小白鼠來測定分離菌的致病性。試驗組和對照組小白鼠的分配用隨機方法，每組3 只。試驗組每個組的小白鼠接種1 個測試菌株。測試前，將純化后的測試菌株接種至馬丁肉湯，37 ℃下培養(yǎng)20 h。試驗組每只小白鼠采取腹腔接種的方式注射0.2 mL 菌液（5×108CFU/mL）；對照組小白鼠每只注射0.2 mL 馬丁液體培養(yǎng)基。飼養(yǎng)并觀察7 d，記錄小白鼠狀態(tài)，及時對死亡小白鼠解剖，7 d 后全部剖殺。無菌采取脾臟或肝臟，再次進行細菌的分離和鏡檢。

2.5 分離菌藥敏試驗

試驗用紙片擴散法進行[5]。有17 種藥物用于測定：大觀霉素、阿莫西林/克拉維酸、黏桿菌素、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、諾氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢曲松、氨芐西林、卡那霉素、磺胺異惡唑、頭孢噻呋、氧氟沙星和四環(huán)素等。

3 結(jié)果與分析

3.1 病菌分離、培養(yǎng)結(jié)果

病菌在亞硒酸鹽胱氨酸培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)后，試管增菌液呈現(xiàn)紅色渾濁狀；紅色渾濁增菌液在顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)后，呈紫紅色的表面平滑單菌落；在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)后，呈圓形的無色大菌落。通過上述分離純化后，63 份病料中有43 株疑似為沙門氏菌。

用疑似菌涂片、染色后鏡檢，可見細菌為兩端鈍圓、沒有莢膜、也沒有芽孢的革蘭氏陰性菌。

3.2 病菌生化試驗結(jié)果

對43 株疑似沙門氏菌的菌株進行了生化試驗，結(jié)果見表1。

表1 43 株疑似菌生化鑒定結(jié)果

由表1 可知，三糖鐵、甘露醇、鳥氨酸脫羧酶、鼠李糖和葡萄糖等幾個生化試驗項目的陽性反應(yīng)比例為100%；而在蔗糖、氰化鉀、麥芽糖、吲哚、山梨醇、丙二酸鹽、肌醇和脲酶幾個項目的陽性反應(yīng)比例為0。因此，43 株疑似菌符合沙門氏菌的特性。

3.3 分離菌血清型鑒定結(jié)果

從表2 可知，43 株病菌有41 株確定了抗原類型，有2 株未能確定抗原類型。

表2 43 株分離菌抗原鑒定結(jié)果

41 株分離菌的抗原血清型屬B、C1 和E1 群。其中鼠傷寒沙門氏菌有18 株，占到了41.86 %；其次是里森沙門氏菌，占25.58 %；倫敦沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌各占9.3%；姆班達卡和妞蘭沙門氏菌各占4.65 %。

3.4 致病性測定結(jié)果

給小鼠接種后進行觀察，對照組7 d 內(nèi)沒有異常表現(xiàn)，7 d 后剖檢也沒發(fā)現(xiàn)病理變化；其余43 個試驗組的小白鼠均在72 h 內(nèi)表現(xiàn)出沙門氏菌病的臨床癥狀或發(fā)生死亡情況。癥狀有被毛散亂、食欲不振、精神萎靡、呼吸困難、糞軟有黏液。解剖病變以肝臟和脾臟病變?yōu)橹鳎?、脾腫大，肝表面有明顯的壞死灶；淋巴結(jié)腫大；腸內(nèi)充滿氣體和液體，腸黏膜腫脹充血。

從剖檢鼠的脾臟、肝臟中均分離到了沙門氏菌。表明試驗分離到的43 株病菌，無論有沒有定型都有較強致病性。

3.5 藥敏試驗結(jié)果

由表3 可見，本次試驗分離到的沙門氏菌對黏桿菌素敏感性最強（敏感率95.35 %），其次是頭孢噻呋、氧氟沙星和頭孢曲松（敏感率93.02 %）；中敏感的藥物是諾氟沙星（敏感率72.09 %）；而對阿莫西林/克拉維酸耐藥性最強，其次是四環(huán)素、大觀霉素和磺胺異惡唑。

表3 43 株細菌藥敏試驗結(jié)果

4 討論

4.1 細菌血清型

試驗除了2 株未定型菌株外，鑒定出的血清型有鼠傷寒沙門氏菌、里森沙門氏菌、德爾卑、倫敦沙門氏菌、姆班達卡和妞蘭沙門氏菌?？梢?，在晉東南地區(qū)流行的沙門氏菌有多種血清型。在流行的血清型中，鼠傷寒和里森沙門氏菌為優(yōu)勢血清型，占到了該試驗中定型菌株的70.73 %，是該地區(qū)的主要血清型。該地區(qū)養(yǎng)殖場在預(yù)防豬沙門氏菌時，應(yīng)以鼠傷寒沙門氏菌和里森沙門氏菌為主要對象。

4.2 細菌致病性

在細菌致病性試驗中，43 株沙門氏菌均引起小白鼠的臨床癥狀，或發(fā)生器官的病理變化，或引起死亡。所以，在晉東南地區(qū)流行的豬源沙門氏菌毒力較大，有較強的致病性，應(yīng)該引起養(yǎng)殖人員的重視，以防沙門氏菌病的發(fā)生。

4.3 細菌耐藥性

試驗發(fā)現(xiàn)，晉東南地區(qū)豬源沙門氏菌對黏桿菌素敏感性最高，其次是頭孢噻呋、氧氟沙星和頭孢曲松，所以，在晉東南地區(qū)治療豬沙門氏菌病時，應(yīng)首先選用這幾種藥物；少用諾氟沙星；禁用四環(huán)素、磺胺異惡唑、大觀霉素等藥物。

我國生豬生產(chǎn)密度大，沙門氏菌傳染性又較強，很容易造成豬群感染，控制不及時還會造成人的感染，后果嚴重[6]。在晉東南地區(qū)，近幾年豬沙門氏菌病頻繁發(fā)生，這主要是沙門氏菌有致病性的血清型較多，養(yǎng)殖人員在沒有弄清流行血清型的情況下就進行預(yù)防，效果很差[7]。本次試驗找出了該地區(qū)豬場流行的沙門氏菌血清型，供養(yǎng)殖場在預(yù)防該病時參考，并建議豬場用本場流行的血清型自制疫苗預(yù)防。試驗也找出了該地區(qū)流行的豬源沙門氏菌的敏感藥物，供豬場在治療豬沙門氏菌病時參考。