潘奎，石玉祥

（河北工程大學食品工程與生命科學學院，河北 邯鄲 056000）

黃曲霉毒素（AF）是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌合成產生的擁有雙呋喃環(huán)及氧砸萘鄰酮（香豆素）結構的真菌毒素[1]。目前已發(fā)現20 多種黃曲霉毒素，主要分為G1、G2、B1、B2、M1、M2 六種類型[2]。其中AFB1 毒性最強，已于1993 年被國際癌癥研究機構（IARC）歸類為1 類致癌物[3]。因其對動物的強毒性作用，成為研究最為深入的真菌毒素之一。其對機體的損害可表現為致癌性、致畸性、誘變性、免疫抑制，嚴重威脅畜禽的健康及食品安全。AFB1 在動物機體內經CYP450 酶系代謝，P450 酶系主要產生于肝細胞[4]。因而導致了AFB1 對肝臟的特殊親和性。且動物攝入AFB1 后，大部分通過十二指腸吸收再經過門靜脈途徑蓄積于肝臟[5]。故肝臟成為AFB1 損傷的最主要器官。

槲皮萬壽菊素是近年來新開發(fā)的黃酮類化合物，具有提高生產性能、抗氧化等多種功效[6，7]。研究發(fā)現，一些天然植物提取物能有效緩解AFB1 對肝臟的損害作用[8，9]。但目前未見槲皮萬壽菊素對AFB1 及其他真菌毒素致動物肝臟損傷的保護性研究，此研究領域是一個空白。本實驗參考前人研究構建AFB1 損傷肉雞模型[10]，研究槲皮萬壽菊素對AFB1 損傷肝臟的保護作用及生產性能的影響，為畜禽養(yǎng)殖中實際應用槲皮萬壽菊素及新型飼料添加劑研發(fā)提供理論依據。

1 材料

1.1 主要材料

AFB1，麥克林試劑有限公司；槲皮萬壽菊素，晨光生物有限公司；黃芪多糖，華畜獸藥有限公司；AST 試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；ALT 試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；二甲苯，國藥集團化學試劑有限公司；石蠟，Leica；H.E 染色試劑盒，北京中科萬邦生物科技有限公司；中性樹膠封片劑，北京中科萬邦生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

離心機，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司DM0424；酶標儀，邁瑞MR-96A；脫水機，武漢俊杰電子有限公司JT-12S；包埋機、凍臺，武漢俊杰電子有限公司JB-P7；石蠟切片機，德國LeicaRM2235；組織攤片機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司KD-P；烤片機，常州國華電器有限公司DB-B2；烤箱，邦西儀器科技（上海）有限公司101-1BS；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)，日本尼康；數字切片掃描系統(tǒng)，寧波江豐生物信息技術有限公司KFPRO-120。

2 方法

2.1 污染飼料的配制

將20 mg AFB1 溶于10 mL 甲醇溶液中，均勻噴灑在飼料中，風干。

2.2 試驗設計

選取108 只1 日齡，體重相近，健康狀況良好的三黃雞。按照隨機分組試驗設計，分為6 個組，每組3個重復，每個重復6 只雞。對照組飼喂基礎日糧，其他試驗組在基礎日糧基礎上添加2.8 mg/kg AFB1、2.8 mg/kg AFB1＋200mg/kg 槲皮萬壽菊素、2.8 mg/kg AFB1＋400 mg/kg 槲皮萬壽菊素、2.8 mg/kg AFB1＋600 mg/kg 槲皮萬壽菊素、2.8 mg/kg AFB1＋600 mg/kg黃芪多糖，連續(xù)飼喂7 d 后更換為對照組飼喂基礎日糧、200 mg/kg 槲皮萬壽菊素、400 mg/kg 槲皮萬壽菊素、600 mg/kg 槲皮萬壽菊素、600 mg/kg 黃芪多糖，連續(xù)飼喂至21 d。常規(guī)免疫，不限制雛雞飼料飲水，試驗第1 周的飼養(yǎng)溫度控制在33～35 ℃，之后根據雞群狀態(tài)和活動表現，每周下降2～3 ℃，直至到26 ℃。整個試驗過程當中，濕度控制在60%～70%。

2.3 樣品采集

試驗第21 d，各組每個重復各選2 只雞進行翅下靜脈采血0.5 mL，3000 r/min 離心10 min，分離血清，凍存于-20 ℃冰箱等待檢測。樣品雞屠宰后，分別取出肝臟組織，稱重后，用4%多聚甲醛浸泡固定48 h。

2.4 生產性能指標的測定

試驗第21 d，稱量肉雞體重，整個試驗周期以重復籠計算采食量。肝臟稱重后，計算器官指數。計算公式如下：

2.5 病理的測定

2.5.1 石蠟切片的制備

（1）取材固定：肝臟取材后，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h。

（2）脫水：將組織塊依次放入75%、85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇溶液中浸泡45 min。

（3）透明：脫水后的肝組織浸泡于二甲苯溶液25 min，更換二甲苯溶液再浸泡25 min 進行置換。

（4）浸蠟：透明后的組織浸泡于65℃蠟液中3 h進行置換組織中的二甲苯。

（5）包埋：把浸蠟后的組織水平放在包埋盒中心，將熔化后的石蠟緩慢倒入包埋盒，待石蠟凝固后，用刀修成長方體小塊。

（6）切片：用切片機勻速連續(xù)地切片，厚度4 μm，將切片放入40 ℃水浴鍋中展平，待切片無皺折后，用黏附載玻片將切片取出。

（7）烘片：將附有切片的載玻片放在37 ℃烘片機上烘干。

2.5.2 H-E 染色

（1）脫蠟：將烘干固定的切片浸泡于二甲苯溶液10 min 后，再更換二甲苯溶液浸泡10 min 置換出切片石蠟。

（2）水化：經兩次無水酒精洗去二甲苯溶液，每次5 min，然后依次經95%、90%、80%、70%酒精進行水化，各5 min，蒸餾水洗去酒精。

（3）蘇木精染色：將切片浸泡在蘇木素染色液中5 min，用流水沖洗25 min；再將切片放入1%鹽酸酒精中浸泡1 min，蒸餾水水洗。

（4）返藍：將切片浸泡在氨水中2 min，蒸餾水水洗。

（5）伊紅染色：切片浸入伊紅染色液4 min后，用流水沖洗1 min。

（6）脫水：切片依次經70%、80%、90%、95%及兩份無水酒精進行脫水，各2 min。

（7）透明：切片脫水后，浸入二甲苯I（5 min）、二甲苯II（10 min）進行透明。

（8）封片：將已透明的切片滴上樹脂膠，用蓋玻片封固。

（9）觀察：待樹脂膠干后，在光學顯微鏡下觀察肉雞肝臟組織病理變化

2.6 AST、ALT 的測定

將采集的血液3000 r/min 離心收集血清，按照試劑盒說明進行檢測天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）與谷草轉氨酶（ALT）。

3 結果與分析

3.1 槲皮萬壽菊素對染毒肉雞生產性能的影響

由表1 可知，在整個試驗期間，與對照組相比，飼喂AFB1（2.8 mg/kg）污染飼糧組的肉雞平均日增重與肝指數顯著降低（P<0.05），料重比顯著升高（P<0.05）。而飼喂槲皮萬壽菊素或黃芪多糖的肉雞平均日增重、肝指數、料重比均有一定程度改善。槲皮萬壽菊素及黃芪多糖均能提升肉雞平均日增重，其中高劑量槲皮萬壽菊素組及黃芪多糖組較模型組具有顯著性差異（P<0.05）。對于染毒造成的肉雞料重比升高，低中高劑量槲皮萬壽菊組及黃芪多糖組均有一定程度的降低，但無顯著性差異。低中高劑量槲皮萬壽菊素組及黃芪多糖組也能提高AFB1引起的肝指數降低，其中高劑量槲皮萬壽菊素組及黃芪多糖組肉雞肝指數較模型組具有顯著性差異（P<0.05），而低中劑量槲皮萬壽菊素組較模型組不具有顯著性差異。

表1 肉雞生產性能統(tǒng)計

3.2 槲皮萬壽菊素對染毒肉雞肝臟病理的影響

對肝臟進行切片HE 染色后，鏡下觀察肝臟組織病理學變化。圖2 所示，對照組肝臟結構正常，肝小葉結構完整，排列整齊。模型組可見肝小葉結構紊亂，肝細胞索不明顯，肝細胞空泡變性嚴重，壞死崩裂、門管區(qū)纖維組織增生，并從血管區(qū)向周圍延伸。較模型組比較，黃芪多糖組及槲皮萬壽菊素低中高劑量組肝細胞空泡變性減輕，血管區(qū)纖維增生減輕。結果表明，槲皮萬壽菊素可明顯改善由AFB1引起的肝臟病理變化，對肉雞肝臟具有一定的保護作用。

圖2 肉雞肝臟組織病理結果（150×）

3.3 槲皮萬壽菊素對染毒肉雞血清AST、ALT 的影響

天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）與谷草轉氨酶（ALT）是存在于肝細胞的兩種酶類。當肝細胞遭受損傷，細胞膜通透性改變，血液中AST、ALT 明顯升高。因此，我們通過測定血清中的AST、ALT 水平，來評判槲皮萬壽菊素對AFB1 所致肉雞肝臟損傷的影響。圖3 所示，模型組肉雞血清AST、ALT 酶活性顯著高于對照組（P<0.05），表明飼喂AFB1 肉雞肝臟細胞遭受損傷。與模型組相比，低中高槲皮萬壽菊素組及黃芪多糖組AST、ALT 顯著性降低（P <0.05）。這表明，槲皮萬壽菊素對AFB1 引起的肉雞肝臟損傷具有一定的改善作用。

圖3 槲皮萬壽菊素對染毒染毒肉雞血清中AST、ALT 的影響

4 討論

AFB1 可降低生長速度、飼料轉換效率和增加疾病發(fā)病率、死亡率，對家禽業(yè)造成巨大的經濟損失。本研究顯示了連續(xù)7 d 飼喂2.8 mg/kg AFB1 對肉雞生長性能的毒性作用。這些結果與以往的研究結果一致[2]。這些不良反應可以解釋為AFB1 造成的畜禽蛋白質合成和脂肪生成的抑制有關。

肝臟是AFB1 損害的主要靶器官。飼喂AFB1的肉雞肝臟指數顯著降低，表明肝臟腫大，而飼喂AFB1 飼糧同時飼喂槲皮素能改善肉雞肝臟指數。與血清生化變化相關的研究結果表明，與對照組相比，受2.8 mg/kg AFB1 污染的飼糧顯著增加了AST、ALT 酶的活性（P<0.05）。AST 和ALT 的升高可能是由于壞死或細胞膜通透性的改變導致的肝細胞的破壞。這些結果與之前的研究結果一致[11]。而添加槲皮萬壽菊能改善這一結果。在黃曲霉毒素的生物轉化過程中，它產生大量的活性代謝物，這些代謝物與DNA、蛋白質等大分子結合，破壞肝臟結構，造成肝臟細胞空泡變性嚴重，門管區(qū)纖維組織增生并向四周彌漫生長。飼糧中添加200、400、600 mg/kg 水平的槲皮萬壽菊素顯著改善了AFB1引起的肝臟病理改變。

5 結論

飼糧中添加槲皮萬壽菊素能顯著改善AFB1引起的肉雞肝臟損傷，提高生產性能。為開擴槲皮萬壽菊素的新應用及新型飼料添加劑的研發(fā)提供了試驗依據。