劉之睿，黃嘉瑤，蘇榮，陳濛濛，彭春婷，唐青海，唐斯萍

（衡陽師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，生命科學(xué)學(xué)院，南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物微生物新型檢測技術(shù)及生物制劑衡陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421008）

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的高度傳染性消化道疾病。該病以引發(fā)2 周齡內(nèi)的仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、劇烈脫水為主要特征，感染后仔豬體重迅速減輕、脫水，1 周內(nèi)死亡[1]，死亡率高達(dá)100%。TGEV 屬于冠狀病毒科α 冠狀病毒（Coronavirus），基因組為不分段的單股正鏈RNA，其大小為2.86×104bp，線性結(jié)構(gòu)順序?yàn)?'-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-E-M-N-ORF7-3'[2]。共編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S、M、N、E）和三種非結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a/1b、ORF3a/3b 和ORF7[3]。其中S 蛋白是典型的I 型病毒融合膜蛋白[4]，可以與宿主細(xì)胞受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒入侵易感細(xì)胞，確定病毒的組織親嗜性和侵染宿主細(xì)胞的范圍，是病毒的毒力蛋白。其C 端區(qū)域高度保守，N 端區(qū)域能與紅細(xì)胞表面唾液酸作用，具有血凝活性[5]，膜外區(qū)上分布著A、B、C、D 四個(gè)主要的抗原位點(diǎn)[6]。S 蛋白在腸道中復(fù)制的能力與毒力直接相關(guān)[7]，并且是唯一能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白[8]。因此，TGEV菌株的差異及其感染潛力高度依賴于S 蛋白[9]。S蛋白不僅是研究TGEV 基因工程疫苗的主要抗原，對(duì)病毒病原的檢測也具有重要意義。

本試驗(yàn)對(duì)TGEV 毒株編碼的S 蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，通過各項(xiàng)條件優(yōu)化得到一株高效表達(dá)菌株，表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，并采用試劑盒純化，為進(jìn)一步研究相應(yīng)的抗體檢測試劑盒和基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因、感受態(tài)細(xì)胞、載體

重組菌株Rosetta（DE3）-pET28a-TGEV-S2/3由衡陽師范學(xué)院南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生物藥物校企聯(lián)合研發(fā)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；pET28a（+）載體為Novagen 公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑、材料

IPTG、內(nèi)切酶（BamH Ⅰ、Hind Ⅲ）購自TaKaRa公司；一抗His-Tag、二抗Goat-Anti-Mouse，均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜于Millipore公司購得；Bacterial Protein Extraction Kit（細(xì)菌蛋白提取試劑盒）購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；Axyprep 質(zhì)粒DNA 小劑量提取試劑盒購于愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 TGEV S2、S3 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

取重組菌株Rosetta（DE3）-pET28a-TGEV-S2/3 進(jìn)行首次活化，將帶有目的基因TGEV S2、S3 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），構(gòu)建出BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S2、BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S3 兩個(gè)菌種，次日抗性篩選陽性克隆，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h 后挑取單菌落，保菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，拍照記錄電泳結(jié)果。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE 和Western blot 檢測

取陽性重組表達(dá)菌株進(jìn)行首次活化，按照1∶200的比例將菌液分別接種于兩管含有Kana（終濃度為200 μg·mL-1）的4 mL LB 液體培養(yǎng)基中，放入37 ℃搖床，220 r·min-1震蕩培養(yǎng)16～18 h。次日，按1 ∶4 的比例進(jìn)行二次活化，分別將首次活化后的1 mL 菌液接種于兩管4 mL 含Kana（終濃度為200 μg·mL-1）的LB 液體培養(yǎng)基中，放入37 ℃搖床，220 r·min-1震蕩培養(yǎng)2.5 h。其后取1 組誘導(dǎo)，剩余的1 組培養(yǎng)基不加誘導(dǎo)劑IPTG 作為對(duì)照組，37 ℃，加入IPTG（終濃度為1.0 mmol·L-1）220 r·min-1誘導(dǎo)4 h，收集菌體，經(jīng)過PBS 洗滌后用細(xì)菌蛋白提取試劑盒裂解蛋白，離心10 min，包涵體用200 μL 包涵體溶解液懸起，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。

取樣品進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，轉(zhuǎn)膜，2%脫脂奶粉-PBS 封閉，PBST 洗滌；進(jìn)行一抗孵育（1 ∶3000稀釋）；PBST 洗滌；進(jìn)行二抗孵育（1 ∶5000 稀釋）；PBST 洗滌，用DBA 顯色液顯色。

1.2.3 表達(dá)條件的優(yōu)化

最佳誘導(dǎo)溫度實(shí)驗(yàn)：按二次活化總量20 mL 活化培養(yǎng)細(xì)菌，當(dāng)菌液OD600nm= 0.6～0.8 時(shí)，每管加入終濃度為1.0 mmol·L-1IPTG，分別置于15 ℃、28 ℃、37 ℃，220 r·min-1誘導(dǎo)4 h 后，收集菌體，將得到的菌體經(jīng)過PBS 溶解冰浴超聲，功率60%，超2 s，停5 s，每管合計(jì)30 min，離心取沉淀加包涵體溶解液溶解，放置于-20 ℃保存。取蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE 電泳檢測。

最佳誘導(dǎo)劑濃度實(shí)驗(yàn)：方法同上，當(dāng)菌液OD600nm= 0.6～0.8 時(shí)，選擇最佳誘導(dǎo)溫度，不同IPTG 濃度（0、0.001、0.01、0.1、1.0 mmol·L-1IPTG），220 r·min-1誘導(dǎo)4 h，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。

最佳誘導(dǎo)時(shí)間實(shí)驗(yàn)：方法同上，當(dāng)菌液OD600nm=0.6～0.8 時(shí)，選擇最佳誘導(dǎo)溫度、最佳誘導(dǎo)劑濃度分別誘導(dǎo)不同時(shí)間（2 h、4 h、8 h、16 h），進(jìn)行SDSPAGE 電泳檢測。

1.2.4 重組蛋白的純化

對(duì)重組菌株BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S2 和BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S3 按照按1 ∶2 的比例進(jìn)行二次活化。取1 組加入IPTG（終濃度為1.0mmol·L-1）誘導(dǎo)，剩余的1 組培養(yǎng)基中不加誘導(dǎo)劑IPTG 作為對(duì)照組，菌液經(jīng)PBS 洗滌后使用PBS 進(jìn)行第一次冰上超聲，功率60%，超5 s，停10 s，每管合計(jì)50 min，離心后取沉淀再加包涵體洗滌緩沖液（在包涵體洗滌液中加入終濃度為1%的Triton X-100）將菌體溶解，進(jìn)行第二次冰上超聲，功率60%，超5 s，停10 s，每管合計(jì)30 min，離心后沉淀用包涵體溶解液溶解，置于-20 ℃保存，按照碧云天His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書進(jìn)行純化后，取純化蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組TGEV S 表達(dá)載體的鑒定

結(jié)果顯示S2、S3 雙酶切結(jié)果均出現(xiàn)了兩個(gè)顯色條帶，第2、4 泳道在5369 bp 與750 bp 各有一條帶；其中大小為750 bp 的條帶代表目的基因TGEV-S 片段，5000 bp 左右為載體pET28a（5 369 bp）條帶，表明挑取的BL21（DE3）-pET28a-TGEVS2、BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S3 重組菌株均為陽性，重組質(zhì)粒pET28a-TGEV-S 已成功轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中（圖1）。

圖1 pET28a-TGEV-S2、pET28a-TGEV-S3 質(zhì)粒及雙酶切電泳鑒定

2.2 重組TGEV S 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

2.2.1 pET28a-TGEV-S 的誘導(dǎo)表達(dá)

在誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG 濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)，誘導(dǎo)4 h，目的蛋白在包涵體中表達(dá)，且上清中不存在目的蛋白，目的蛋白S2、S3 條帶分別約為28 kDa 與30 kDa，未誘導(dǎo)對(duì)照組無明顯蛋白條帶（圖2），表明TGEV S 基因誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖2 重組蛋白TGEV-S2、TGEV-S3 的SDS-PAGE 檢測

2.2.2 重組TGEV S 蛋白的Western blot 鑒定

將與2.2.1 中的SDS-PAGE 試驗(yàn)中相同的蛋白膠經(jīng)轉(zhuǎn)膜后采用一抗His-Tag，二抗Goat-Anti-Mouse 進(jìn)行孵育，結(jié)果顯示，pET28a-TGEV-S 包涵體蛋白分別在28 kDa、30 kDa 處有目的條帶（圖3），說明包涵體形式的重組蛋白能與一抗發(fā)生特異性結(jié)合。

圖3 重組蛋白TGEV-S2、TGEV-S3 的Western blot 鑒定（His 單克隆抗體）

2.3 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳誘導(dǎo)溫度

溫度分別為15 ℃、28 ℃、37 ℃，IPTG 濃度為1.0 mmol·L-1下誘導(dǎo)4 h。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)溫度為15 ℃時(shí)的蛋白表達(dá)量明顯低于28 ℃和37 ℃，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28 ℃時(shí)，蛋白表達(dá)量最高，且只以包涵體形式存在，在上清中未見有目的蛋白表達(dá)（圖4、圖5）。M：Marker；1～8 依次為：BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S2 37℃誘導(dǎo)上清、誘導(dǎo)包涵體、28℃誘導(dǎo)上清、誘導(dǎo)包涵體、15℃對(duì)照上清、對(duì)照包涵體、誘導(dǎo)上清、誘導(dǎo)包涵體；9～16 依次為:BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S3 37℃誘導(dǎo)上清、誘導(dǎo)包涵體、28℃誘導(dǎo)上清、誘導(dǎo)包涵體、15℃對(duì)照上清、對(duì)照包涵體、誘導(dǎo)上清、誘導(dǎo)包涵體。

圖4 TGEV-S2、TGEV-S3 誘導(dǎo)溫度表達(dá)條件優(yōu)化SDS-PAGE 檢測

圖5 TGEV-S2、TGEV-S3 誘導(dǎo)溫度表達(dá)條件優(yōu)化Western blot 鑒定

2.3.2 最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度

誘導(dǎo)溫度為28 ℃，IPTG 濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)4 h。結(jié)果表明IPTG 濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)，S 蛋白表達(dá)量最高，且僅以包涵體形式表達(dá)，0.1 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)時(shí)，目的蛋白疑似在上清有表達(dá)（圖6）。

圖6 TGEV-S2、TGEV-S3 誘導(dǎo)劑濃度表達(dá)條件優(yōu)化SDS-PAGE 檢測

2.3.3 最佳誘導(dǎo)時(shí)間

誘導(dǎo)溫度為28 ℃，IPTG 濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間分別為2 h、4 h、8 h 和16 h。結(jié)果顯示，改變誘導(dǎo)時(shí)間，目的蛋白在誘導(dǎo)4 h 時(shí)表達(dá)量最高，且只存在于包涵體中（圖7、圖8）。由2. 3. 2 中可知，在0.1 mmol·L-1IPTG 濃度下，TGEV S 蛋白疑似有在上清中的可溶性表達(dá)，經(jīng)Western blot 鑒定表明，在上清中沒有目的蛋白與抗體的特異性結(jié)合，說明在0.1 mmol·L-1IPTG 條件下誘導(dǎo)時(shí)，上清中無目的蛋白的表達(dá)（圖9、圖10）。

圖7 誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)條件優(yōu)化的SDS-PAGE 檢測（1.0mmol·L-1 IPTG）

圖8 誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)條件優(yōu)化的Western blot 鑒定（1.0mmol·L-1 IPTG）

圖9 誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)條件優(yōu)化的SDS-PAGE 檢測（0.1mmol·L-1 IPTG）

圖10 誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)條件優(yōu)化的Western blot 鑒定（0.1mmol·L-1 IPTG）

2.4 重組TGEV S 蛋白的純化

誘導(dǎo)溫度為37 ℃，IPTG 濃度為1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間分別為4 h，培養(yǎng)結(jié)束后使用His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化。結(jié)果顯示，菌體沉淀溶解液在28 kDa 與30 kDa 處均出現(xiàn)目的蛋白且濃度較高，后續(xù)洗脫液的條帶在均在28 kDa 與30 kDa 附近，且目的蛋白含量較少，判斷目的蛋白純化已經(jīng)成功（圖11）。

圖11 TGEV-S2、S3 大量純化的SDS-PAGE 檢測

3 討論

本試驗(yàn)擴(kuò)增構(gòu)建了TGEV-S2、TGEV-S3 重組原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了表達(dá)條件的優(yōu)化與純化。結(jié)果顯示，重組菌株酶切產(chǎn)物均存在5369 bp 與750 bp 兩條帶，表明成功獲得了BL21（DE3）-pET28a-TGEV-S2S3 陽性克隆菌株，SDS-PAGE 檢測TGEV-S2、TGEV-S3 分別在28 kDa、30 kDa 處附近存在目的條帶，符合預(yù)期分子量大小。Western blot 鑒定表明，目的蛋白僅在誘導(dǎo)后的包涵體中出現(xiàn)了表達(dá)，上清均未在預(yù)期蛋白分子量處出現(xiàn)特異性印跡，因此希望通過誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，探究TGEV-S2 蛋白的可溶性表達(dá)。

綜合考慮耗材、時(shí)間以及蛋白表達(dá)量等因素，得出目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為在28 ℃下，以1.0 mmol·L-1IPTG 濃度，誘導(dǎo)4 h。在15 ℃條件下誘導(dǎo)時(shí)的蛋白表達(dá)量明顯低于28 ℃和37 ℃，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28 ℃時(shí)，蛋白表達(dá)量較37 ℃時(shí)略有提高，且其的表達(dá)形式不隨溫度變化而改變；同時(shí)，增減IPTG 濃度無助于目的蛋白表達(dá)量的提高，但是在0.1 mmol·L-1IPTG 濃度下，TGEV-S2 蛋白疑似有在上清中的可溶性表達(dá)；在1.0 mmol·L-1IPTG濃度條件下，誘導(dǎo)4 h 時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最高，如果再將誘導(dǎo)時(shí)間延長為8 h 乃至更長，蛋白量表達(dá)仍無明顯增加，而在0.1 mmol·L-1IPTG 濃度下，經(jīng)Western blot 鑒定表明TGEV-S 蛋白仍無在上清中的可溶性表達(dá)。

現(xiàn)研究已表明，TGEV 的免疫屬于獲得自母豬母乳的被動(dòng)免疫，而仔豬由于免疫系統(tǒng)還未發(fā)育完全導(dǎo)致了病死率的大幅上升。自1946 年美國出現(xiàn)后，在亞歐多國豬群間相繼爆發(fā)，TGEV 的有效種群規(guī)模在1960—1970 年間快速增長[10]。盡管針對(duì)豬傳染性胃腸炎疾病的研究已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，近年來仍有調(diào)查結(jié)果顯示，TGEV 在意大利南部坎帕尼亞地區(qū)豬群間流行程度僅次于PEDV，是當(dāng)?shù)氐诙筘i腹瀉致病源[11]。

數(shù)年間，人們嘗試過針對(duì)病毒各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行檢測和免疫，它們各有優(yōu)勢：M 蛋白保守性高，具有啟動(dòng)病毒粒子組裝、促使病毒釋放的作用[12]，張小波等人采用pGEX-6P-1 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Rossetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)了全長的M 蛋白[13]，因含有GST-Tag 的表達(dá)系統(tǒng)，便于后續(xù)純化操作，而本研究采用His-Tag 的表達(dá)系統(tǒng)，雖然目的產(chǎn)物的表達(dá)量高但難以純化；N 蛋白是一種磷酸化蛋白，影響TGEV 基因組RNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的加工[14]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，由于其同樣具有高保守性，郭宏偉等人以pET28a 為載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞在47 kDa 處表達(dá)了重組TGEV N 蛋白，以包涵體形式存在，具有良好的免疫原性[15]。而本研究采用相同的原核表達(dá)體系成功表達(dá)的TGEV S 蛋白同樣為包涵體形式。由此可見，TGEV的不同結(jié)構(gòu)蛋白在相同的表達(dá)載體中均以包涵體形式表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)TGEV S 蛋白包含139 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，24 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和53 個(gè)表位[16]，與其他豬腸道冠狀病毒相比，糖基化位點(diǎn)含量最高，在原核表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)糖基化易影響其折疊行為和溶解性產(chǎn)生包涵體蛋白。但不可忽視的是，原核表達(dá)系統(tǒng)在蛋白質(zhì)生產(chǎn)、操作、便利性和生產(chǎn)成本方面具有巨大優(yōu)勢[17]。由于S 蛋白可以誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)，促進(jìn)病毒與細(xì)胞的融合，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，所以目前大多仍選擇S 蛋白作為TGE 診斷、疫苗研發(fā)的目標(biāo)靶點(diǎn)。近年來，劉娜等針對(duì)S 蛋白S1 亞基構(gòu)建了重組載體pET28a-TGEV-CTD 并將其轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21 中表達(dá)，開發(fā)了一種小鼠單克隆抗體[18]；于天飛等通過將S 基因抗原表位D 與原核表達(dá)載體pET-32a 重組表達(dá)，對(duì)C、D 表位的抗原性進(jìn)行了比較[19]；鄭仲華等將截?cái)郤 基因與載體pET-32a連接重組轉(zhuǎn)化到BL21 中，同樣以包涵體狀態(tài)表達(dá)出了目的蛋白，但His 標(biāo)簽純化過程中存在目的蛋白部分二聚化的問題[20]。本研究擴(kuò)增的TGEV 截短S2、S3 片段能較好地適用于His 標(biāo)簽純化柱，成功純化出了目的蛋白。因此，本實(shí)驗(yàn)純化出的S蛋白在前人的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一定優(yōu)化，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，異源基因已在原核載體中成功表達(dá)，可以用于產(chǎn)生抗體、中和病毒或分析蛋白功能。

綜上所述，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了一株高效表達(dá)TGEV 毒株S 基因的菌株，重組蛋白TGEV-S以包涵體形式存在，表達(dá)量大，純化方便，為后續(xù)基因工程亞單位疫苗、診斷試劑研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。