黃章程

（福建賽福食品檢測(cè)研究所有限公司，福建福州 350100）

民以食為天，當(dāng)食品發(fā)生安全問(wèn)題后不僅會(huì)使社會(huì)的誠(chéng)信機(jī)制受到消極影響，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)使廣大人民群眾的生命安全遭遇威脅。進(jìn)入新時(shí)代后，為了有效保障食品安全，提升全民素質(zhì)，完善了原有的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系。但是，在實(shí)施過(guò)程中并不能從根本上杜絕部分商家通過(guò)非法手段從事制假、摻假、售假等違法犯罪活動(dòng)。因而，在當(dāng)前階段十分有必要加強(qiáng)對(duì)食品安全評(píng)估和檢測(cè)的研討，利用先進(jìn)的檢測(cè)方法提高其評(píng)估和檢測(cè)效率及質(zhì)量，為食品安全管理提供技術(shù)支撐等。

1 蛋白質(zhì)化學(xué)檢測(cè)方法的基本原理

蛋白質(zhì)屬于大分子化合物，由氨基酸脫水而來(lái)。化學(xué)組成元素包括了C、O、N、H、S、P 及微量元素等（圖1），理化特性如下：①氨基酸特性；②高分子性質(zhì)；③水合作用；④顯色反應(yīng)等。近幾年蛋白質(zhì)化學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用的方法主要有兩種，一種是凱氏定氮法，另一種是高效液相色譜法，兩種方法不僅在檢測(cè)原理方面存在較大差異，而且適用范圍有所不同。

圖1 蛋白質(zhì)組成元素及含量示意

1.1 以凱氏定氮法為例

該方法已有一百多年的歷史，具有可靠性高、應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)。從全球范圍看，多數(shù)國(guó)家、專業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)，都將其作為蛋白質(zhì)檢測(cè)方面的標(biāo)準(zhǔn)方法，有效落實(shí)到了食品安全評(píng)估和檢測(cè)之中。目前，我國(guó)在食品安全評(píng)估和檢測(cè)中，將其作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的重要方法對(duì)其進(jìn)行了推廣應(yīng)用。從原理方面看，凱氏定氮法包括消化、蒸餾、滴定。具體如下：①消化環(huán)節(jié)主要是在氧化反應(yīng)的條件下把被測(cè)樣品中的含氮化合物轉(zhuǎn)化氨氣，同時(shí)以硫酸銨的形式分離出其中的氮元素。②蒸餾環(huán)節(jié)主要是把氨從消化產(chǎn)物中分離出來(lái)，并通過(guò)滴定方式定量分析溶液內(nèi)的氨離子。消化、蒸餾、滴定三大檢測(cè)步驟對(duì)應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)式如下：

1.2 以高效液相色譜法為例

高效液相色譜法（HPLC）屬于色譜法，主要是在經(jīng)典液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)的新型檢測(cè)方法，優(yōu)勢(shì)集中表現(xiàn)在應(yīng)用范圍大、分離速率高、準(zhǔn)確度高、靈敏度高等方面，尤其在揮發(fā)性化合物、高沸點(diǎn)化合物檢測(cè)方面具有較好的應(yīng)用效果。目前，在國(guó)內(nèi)的食品檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)方面，對(duì)其進(jìn)行了推廣應(yīng)用。從原理方面看，該方法主要是從物化性質(zhì)差異出發(fā)，以液體作為流動(dòng)相，利用高壓輸液系統(tǒng)、物質(zhì)溶解度、物質(zhì)蒸氣壓等，分離物質(zhì)流動(dòng)相和固定相色譜柱中的物質(zhì)組分。以液相色譜柱分離為例，假定分布系數(shù)、分離因子分別為a和k，可以根據(jù)公式對(duì)n個(gè)液相色譜柱的分離效率R進(jìn)行有效計(jì)算。具體如下：

2 食品安全評(píng)估和檢測(cè)中對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用

自《食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測(cè)評(píng)估“十四五”規(guī)劃》實(shí)施至今，國(guó)家食品安全管理部門、監(jiān)督部門、專業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)，在食品安全評(píng)估和檢測(cè)中普遍加強(qiáng)了對(duì)凱氏定氮法和高效液相色譜法的應(yīng)用，雖然蛋白質(zhì)檢測(cè)中的兩種方法原理、優(yōu)勢(shì)、劣勢(shì)均存在差異（表1），但是在實(shí)際應(yīng)用中可以滿足大部分食品安全精準(zhǔn)檢測(cè)需求。為了論述的清晰性，下面僅對(duì)凱氏定氮法的應(yīng)用展開具體說(shuō)明。

表1 蛋白質(zhì)檢測(cè)方法原理及優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)

2.1 應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，應(yīng)用凱氏定氮法時(shí)主要是對(duì)食品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。但是，當(dāng)參考值存在較大不確定性時(shí)，不能將該方法作為替代方法實(shí)現(xiàn)對(duì)測(cè)定對(duì)象的準(zhǔn)確評(píng)估。例如，應(yīng)用該方法建立參考值的過(guò)程中，要求檢測(cè)人員對(duì)凱氏定氮法的性能做進(jìn)一步驗(yàn)證，并對(duì)其期望范圍進(jìn)行確認(rèn)。事實(shí)上，應(yīng)用該方法時(shí)牽涉三大檢測(cè)步驟，每個(gè)步驟中的化學(xué)反應(yīng)比較復(fù)雜，通常的測(cè)量時(shí)間不低于10 h，并不能滿足當(dāng)前階段食品安全評(píng)估和檢測(cè)中對(duì)快速測(cè)定的要求。為了解決該問(wèn)題，在離子色譜、凱氏消化方面，可以使用抑制電導(dǎo)檢測(cè)方法，進(jìn)而使消解時(shí)間降至1 h 以內(nèi)，同時(shí)省去該方法中的其他兩個(gè)步驟，進(jìn)而使分析時(shí)間大幅度降低，達(dá)到食品安全評(píng)估和檢測(cè)中對(duì)其準(zhǔn)確度和精密度的要求。再如，部分不良商家為了牟取暴利，會(huì)選擇在食品中摻假牛奶生乳蛋白，此時(shí)檢測(cè)人員可以利用非蛋白質(zhì)氮（NPN）指數(shù)概念，將該方法與三氯乙酸沉淀法（TCA）進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，完成對(duì)一系列牛奶樣品非蛋白質(zhì)氮和蛋白質(zhì)氮的檢測(cè)。以三聚氰胺為例，當(dāng)摻假牛奶中的含量小于0.2 mg/kg 時(shí)NPN 指數(shù)可達(dá)到可辨識(shí)范圍（最小值為0.8084，最大值為1.4987）。檢測(cè)人員可以根據(jù)該條件，應(yīng)用上述兩種方法的聯(lián)合檢測(cè)方式，更為精準(zhǔn)地完成對(duì)富含氮的摻假牛奶質(zhì)量檢測(cè)工作。

2.2 實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器主要包括UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，石墨消解儀。試劑如下：實(shí)驗(yàn)試劑為聚乙烯醇，基準(zhǔn)物為氯化銨、碳酸鈉，分析純包括過(guò)氧化氫（30%），溴甲酚綠，甲基紅，鹽酸，氫氧化鈉，硼酸，硫酸銅、硫酸鉀，硫酸，碘化汞（CP），碘化鉀。實(shí)驗(yàn)食品共計(jì)7種，分別為清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

首先，實(shí)驗(yàn)人員按0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL、2.8 mL、4.0 mL，吸取含N 量為40 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)氯化銨溶液，通過(guò)聚乙烯醇液（0.1 mg/mL）對(duì)其進(jìn)行稀釋處理后，量取奈氏試劑1 mL，加入稀釋液，加入量以25 mL 為準(zhǔn)，然后采用比色法在460 nm 位置進(jìn)行比色，獲取蛋白質(zhì)過(guò)氧化凱氏定氮法標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.034 2x+0.121 6，R2=0.9989。

其次，采用電子天平秤取0.25 g 樣品，將其置于凱氏定氮管中，然后添加硫酸4 mL，置于石墨消解儀上300℃加熱3 min 后，以2 mL/min 的速度添加消化劑15 mL（過(guò)氧化氫和硫酸比例為4：1）繼續(xù)在石墨消解儀上350℃溫度加熱2 min，完成對(duì)過(guò)氧化劑的處理后，取出消解管，冷卻后轉(zhuǎn)移并定容至100 mL。按照比色法吸取0.4 mL 樣品進(jìn)行比色。

第三，根據(jù)GB 5009.5—2016標(biāo)準(zhǔn)要求，應(yīng)用過(guò)氧化凱氏定氮法對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。為了說(shuō)明該方法的測(cè)定優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)人員同時(shí)應(yīng)用常規(guī)凱氏定氮法對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，記錄了相關(guān)測(cè)定數(shù)據(jù)，比較了常規(guī)法、過(guò)氧化法的精密度等。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在7 個(gè)樣品中，應(yīng)用過(guò)氧化法測(cè)定的蛋白質(zhì)含量在37.62%～38.71%，CV 為0.44%。常規(guī)法測(cè)定下的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)為28.0%～38.5%、0.53%。應(yīng)用F 檢驗(yàn)比較后發(fā)現(xiàn)，兩種方法的精密度不具有顯著差異，基本相同。但是，通過(guò)對(duì)清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕七種食品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)二者的對(duì)應(yīng)差值，分別為+0.19、+0.73、+0.16、+0.38、-0.45、+0.70、-22。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)理論，對(duì)兩種方法進(jìn)行比較分析：①當(dāng)測(cè)定次數(shù)增多后，兩種方法測(cè)定值減差值應(yīng)等于0；②在有限測(cè)定次數(shù)內(nèi)，二者的減值不一定等于0，而且與0之間不存在顯著差異。對(duì)應(yīng)到統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方面，檢驗(yàn)假定條件是H0：u=u0，備樣假設(shè)條件為H1：u≠u0。假定顯著性水平α=0.05，那么，本例中的拒絕域|t|＞t0.05，6=2.45，由此說(shuō)明檢驗(yàn)假定條件成立，兩種方法的測(cè)定結(jié)果趨于一致。

但是，在測(cè)定結(jié)果影響方面，應(yīng)用過(guò)氧化劑（ 按0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL）后，消化時(shí)間在2.5～15.0 min，蛋白質(zhì)含量范圍在27.98%～29.98%。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過(guò)氧化劑使用量為5 mL，滴速為2 mL/min 時(shí)，菜籽粕蛋白質(zhì)量含量測(cè)定結(jié)果方面，基本趨于恒定。對(duì)其他樣品進(jìn)行測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)15 mL 的過(guò)氧試劑應(yīng)用效果相對(duì)較好，在滴速不變的情況下消化時(shí)間約在7.5 min。從樣品氮回收率方面看，硫酸與過(guò)氧化氫發(fā)生反應(yīng)后，主要生成的水和HS03OOH 的，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)看，按4：1的比例應(yīng)用30%過(guò)氧化氫和氧化劑硫酸，能夠起到較好的氧化效果，加速消化速度。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論說(shuō)明，在食品蛋白質(zhì)含量測(cè)定中，應(yīng)用過(guò)氧化法，有利于提高凱氏定氮法的應(yīng)用效率，實(shí)用性相對(duì)較高。

3 結(jié)束語(yǔ)

食品安全評(píng)估和檢測(cè)在當(dāng)前階段已變得十分重要，成為食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系的核心內(nèi)容。建議在實(shí)踐中選擇蛋白質(zhì)化學(xué)檢測(cè)方法時(shí)，先對(duì)不同方法下的基本原則全面分析，再根據(jù)不同方法的適用范圍對(duì)其進(jìn)行應(yīng)用。建議在食品評(píng)估和檢測(cè)實(shí)踐中，一方面選擇凱氏定氮法對(duì)食品蛋白質(zhì)質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，另一方根據(jù)面高效液相色譜法的適用范圍，將其應(yīng)用到對(duì)食品蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方面，進(jìn)而提高該方法的應(yīng)用效果。