吳建梅，汪 鈴，劉 金，王 亮*

（江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

泡菜是我國廣受消費者喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜食品[1]。我國的泡菜歷史悠久，傳承至今，據(jù)記載，腌泡菜最早可以追溯到3 000多年前的商周時期[2]。目前泡菜生產(chǎn)大多基于家庭自制的自發(fā)發(fā)酵過程，是將大白菜、甘藍、蘿卜、菜豆、萵筍等蔬菜作為原料，用一定濃度鹽水或鹵水浸泡，然后放入泡菜壇中在室溫條件下進行密封發(fā)酵6～10 d[3]。其中我國有名的泡菜包括四川泡菜、東北酸菜和涪陵榨菜等[4]。

泡菜的制作通常將蔬菜洗凈后直接浸泡于鹵水中進行厭氧發(fā)酵，這種開放式的生產(chǎn)方式使得泡菜制作成為一個復雜的混菌發(fā)酵過程，原料和環(huán)境中的微生物區(qū)系利用發(fā)酵體系中的營養(yǎng)物質產(chǎn)生代謝物，如有機酸、維生素、氨基酸、細菌素等[5-6]，成熟泡菜中還含有豐富的乳酸菌等有益菌。自然發(fā)酵的泡菜產(chǎn)品風味獨特，極具地域特色[7]。然而原料上的微生物并不總是受控制地生長繁殖，發(fā)酵過程中易受食源性致病菌污染[8-9]，導致其發(fā)酵結果品質不穩(wěn)定，安全性差。香辛料可以改善食品品質[10-11]，且能抑制某些病原菌的生長[12-13]，因此通常被添加到泡菜鹵水中。然而，針對香辛料對泡菜發(fā)酵中微生物多樣性的研究還比較少。

隨著脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）測序技術和生物信息學分析方法的進步和優(yōu)化，高通量測序技術在食品發(fā)酵領域得到廣泛的應用[14-17]。本研究利用高通量測序技術研究兩組泡菜樣品（對照組和添加香辛料組）發(fā)酵結束時的微生物群落結構，比較兩組樣品間微生物群落差異，同時監(jiān)測兩組泡菜在發(fā)酵過程中的pH、總酸及亞硝酸鹽含量變化，分析理化指標與差異物種的相關性。以期確定香辛料在泡菜發(fā)酵中的潛在效益，為泡菜發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大白菜、食用鹽、白砂糖、大蒜、生姜、小紅尖椒：鎮(zhèn)江市市售；泡菜壇（800 mL）：湖南寶升塑業(yè)科技開發(fā)有限公司。

1.1.2 化學試劑

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、鹽酸、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸（均為分析純）：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：南京翼飛雪生物科技有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FE28pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；ZCZY-CS8V型搖床：上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州空泰空氣技術有限公司；HY160冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；DGL-100GL高壓蒸汽滅菌鍋：浙江力辰儀器科技有限公司；UV-200紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；HH-4S型恒溫水浴鍋：上海捷呈實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜的制作工藝流程及操作要點

操作要點：

原料預處理：挑選新鮮的大白菜，清洗干凈，瀝干表面水分，切分為2 cm×2 cm×2 cm的小塊。

未添加香辛料組（P）（對照組）鹵水配制：將鹽300 g，白砂糖100 g加至10 L開水中，充分浸泡，制成含3%鹽和含1%糖的鹵水，冷卻至室溫備用。

添加香辛料組（PS）鹵水配制：將鹽300 g，白砂糖100 g，大蒜400 g，生姜200 g，小紅尖椒200 g加至10 L開水中，充分浸泡，制成含3%鹽、1%糖、4%大蒜、2%生姜和2%小紅尖椒的鹵水，冷卻至室溫備用。

裝壇：按照每壇200 g大白菜，500 mL鹵水裝壇，共制作20壇未添加香辛料泡菜（編號P1～P20）和20壇添加香辛料泡菜（編號PS1～PS20）。

密封發(fā)酵：將泡菜壇密封蓋嚴，置于20 ℃搖床恒溫發(fā)酵6 d，即得泡菜成品。

1.3.2 樣品采集

發(fā)酵時間設為0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d。每天取樣，在每壇泡菜中任選四個位置，各吸取5 mL，每次每壇共取20 mL泡菜汁混勻，從混勻后的泡菜汁中吸取5 mL放入無菌離心管，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集沉淀，-80 ℃冰箱保存，直至測序。剩余15 mL泡菜汁用于pH、總酸、亞硝酸鹽的測定。

1.3.3 理化指標的測定

采用pH計直接測定樣品的pH；參照GB/T12456—2021《食品中總酸的測定》[18]測定樣品的總酸含量；參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[19]中分光光度法測定樣品的亞硝酸鹽含量。

1.3.4 DNA提取及測序

從未添加香辛料組（P）和添加香辛料組（PS）中各選取5個產(chǎn)酸高的樣品和5個產(chǎn)酸低的樣品進行測序。采用基因組DNA提取試劑盒提取泡菜樣本的DNA，細菌通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA基因的V4區(qū)進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。用特異引物515F-806R擴增16S rRNA V4區(qū)基因。PCR擴增體系：MasterMix15μL、正反向引物0.2μmol/L、模板DNA 10 ng。PCR擴增條件：98 ℃初變性1 min，然后98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃，5 min，共30個循環(huán)。本研究中的泡菜樣本PCR擴增產(chǎn)物委托天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成Miseq文庫構建，采用Illumina Miseq平臺進行測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

經(jīng)Illumina Miseq測序后所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、去雜、優(yōu)化后得到有效序列。使用Uparse對所有序列按97%相似水平進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的劃分，再將OTU的代表序列與SILVA（132.8版本）數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋分析。使用R中vegan包計算Chao1和Shannon指數(shù)，并計算組間貝葉斯距離（Bray-Curtis）進行β多樣性分析，基于在線網(wǎng)站（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）進行組間線性判別分析效應大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）。本研究中統(tǒng)計分析及繪圖主要在R軟件（R 4.2.0）中完成。

2 結果與分析

2.1 不同處理組泡菜理化指標分析

P組和PS組泡菜在第6天的理化指標見表1。由表1可知，P2、P11、P12、P13、P19為P組發(fā)酵結束（第6天）的高酸樣品，P1、P14、P5、P7、P17為P組低酸樣品；PS1、PS2、PS4、PS5、PS9為PS組發(fā)酵結束（第6天）的高酸樣品，PS10、PS12、PS13、PS14、PS20為PS組低酸樣品?？偹崾桥莶税l(fā)酵過程中標志成熟的重要參數(shù)，研究表明，發(fā)酵成熟的泡菜中鹵水pH值＜4.0，可滴定酸含量＞0.3 g/100 g[4]。P組中樣本P5、P7、P14、P17在發(fā)酵第6天均未達到成熟時總酸含量0.3 g/100 g。而PS組中所有樣本在發(fā)酵第6天總酸含量均達到規(guī)定標準0.3 g/100 g。與對照組（P組）相比，添加香辛料后同一批樣品中的pH和總酸含量波動較小，且都達到泡菜成熟標準。亞硝酸鹽積累是發(fā)酵蔬菜中常見的安全問題，攝入過量的亞硝酸鹽會危害人體健康，誘發(fā)多種癌癥[20]。P組中P5、P7、P14、P15亞硝酸鹽含量已超過安全限值20 mg/kg[19]，PS組中樣本的亞硝酸鹽含量為0.571～1.796 mg/kg，差異較小，單因素方差分析表明兩組樣品間亞硝酸鹽含量存在顯著差異（P＜0.05）。

表1 不同處理組泡菜在發(fā)酵第6天的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of pickles in different treatment groups on the 6th day of fermentation

綜合上述結果，添加香辛料批次的泡菜與對照組相比呈現(xiàn)出更快的產(chǎn)酸速率，且PS組的各個樣品間理化指標差異小于對照組，在發(fā)酵第6天的亞硝酸鹽含量遠低于標準限值，表明香辛料添加不僅能縮小樣品間的差異，也表現(xiàn)出良好的食用安全性。

2.2 測序數(shù)據(jù)及OTU數(shù)目統(tǒng)計結果

兩組泡菜樣本經(jīng)測序得到的原始下機序列、有效序列及OTU數(shù)目見表2。去除原始序列的接頭信息以及低質量堿基等干擾信息后，所有樣本的有效序列條數(shù)在67 319～87 021之間，每個樣本的平均有效序列數(shù)為78 093。由表2可知，將兩組中的有效序列進行物種注釋，所有樣本共獲得931個OTU，P組各樣本中OTU數(shù)為47～239個，由此可見P組10個樣本間的OTU數(shù)存在較大差異，而PS組各樣本中OTU數(shù)為45～64個，差異較小。由表2亦可知，覆蓋率（Good's coverage）均大于0.99，覆蓋率越高，說明所有樣本中序列未被測出的概率很低。結合稀疏性曲線（圖1）可得，隨著測序深度加深，物種數(shù)先快速上升后趨于平緩，表明本次樣品測序的質量和深度足夠反映絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖1 泡菜樣本稀疏性曲線Fig.1 Rarefaction curves of pickles samples

2.3 微生物群落結構

兩組泡菜樣品在門水平及屬水平上相對豐度前十的微生物群落組成見圖2。由圖2a可知，厚壁菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria）是兩組泡菜樣品中共同的優(yōu)勢門（相對豐度＞1%），此結果與其他發(fā)酵蔬菜的優(yōu)勢細菌門相同[3，21]，證明各發(fā)酵蔬菜微生物間存在共性。厚壁菌門在PS組中相對豐度更高，達到76.41%，在P組中為34.52%。變形桿菌門在P組和PS組中分別占62.74%和20.96%。

圖2 不同處理組泡菜樣本中門（a）和屬（b）水平上微生物群落結構比較Fig.2 Comparison of microbial community structure of pickles samples with different treatment groups at phylum (a) and genus (b) level

由圖2b可知，在屬水平上，兩組泡菜樣品中的優(yōu)勢屬種類大體相同，但同一細菌屬在兩組泡菜樣品中的相對豐度存在差異。P組中的優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）下的未鑒定屬（46.34%）、明串珠菌（Leuconostoc，18.25%）、乳球菌（Lactococcus，9.76%）、假單胞菌（Pseudomonas，4.22%）、弧菌屬（Vibrio，1.95%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，1.92%）、泛菌屬（Pantoea，1.12%）、氣單胞菌（Aeromonas，1.09%）。PS組中的明串珠菌屬（Leuconostoc，70.26%）豐度最高，其次是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）下的未鑒定屬（8.30%）、乳球菌（Lactococcus，2.22%）、弧菌屬（Vibrio，2.19%）、假單胞菌（Pseudomonas，1.66%）、希瓦氏菌（Shewanella，1.31%）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus，1.30%）和泛菌屬（Pantoea，1.17%）。

各細菌屬中，腸桿菌是P組中占比最大的優(yōu)勢屬，此外還檢測出了低豐度的假單胞菌、弧菌屬、泛菌屬、氣單胞菌屬，有研究表明，這些細菌屬在新鮮蔬菜及腌漬蔬菜中被檢測出[22-23]，推測其來源于發(fā)酵原料或者制作過程中的環(huán)境因子如發(fā)酵容器、刀具等，但隨著發(fā)酵過程的進行，這些潛在病原微生物的生長受到抑制甚至在發(fā)酵后期完全消失[24]。假單胞菌和腸桿菌科是發(fā)酵蔬菜中常見的病原菌，有研究表明假單胞菌和腸桿菌科細菌代謝利用氨基酸，產(chǎn)生刺激性氣味，加速食品腐敗[25]，腸桿菌的存在會與乳酸菌競爭發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質并促進亞硝酸鹽的產(chǎn)生[26]。以上結論證實了家庭自制泡菜中容易受到食源性致病菌的污染[27]。

香辛料的加入使得腸桿菌相對豐度從之前的46.34%下降至8.30%，假單胞菌也降低至1.66%，這降低了泡菜發(fā)酵中的致病性。另外明串珠菌從豐度18.25%上升至70.26%，成為PS組的絕對優(yōu)勢菌屬，劉麗宅等[28]研究也表明，明串珠菌是泡菜發(fā)酵中優(yōu)勢菌。此外，乳酸桿菌、片球菌屬、魏斯氏菌、腸球菌、乳球菌等乳酸菌也是泡菜中常見優(yōu)勢屬[29]。大量研究表明乳酸菌主要通過碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，該化合物有助于防止病原微生物和腐敗微生物的生長，因而在傳統(tǒng)泡菜中廣泛存在[30]。

綜上，香辛料可以顯著提高泡菜發(fā)酵體系中乳酸菌的相對豐度，減少有害微生物污染，從而降低許多健康風險。

2.4 微生物群落多樣性分析

2.4.1 微生物群落α多樣性分析

微生物的α多樣性指數(shù)反映了群落內(nèi)物種數(shù)量及其相對豐度，Chao1指數(shù)常用來估計物種總數(shù)，Chao1指數(shù)越大，OTU數(shù)目越多，樣本物種數(shù)比較多。Shannon指數(shù)綜合考慮了物種的豐富度和分布的均勻度，其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高。

兩組泡菜樣品中細菌多樣性指數(shù)分析見圖3。由圖3可知，經(jīng)Wilcoxon檢驗，兩組樣品間Chao1指數(shù)無明顯差異，PS組中Chao1指數(shù)較高，平均為111.46±52.38，表明PS組泡菜中的物種豐富度大。Shannon指數(shù)在PS組中更高，平均為2.48±0.76，顯著高于P組（P＜0.05），表明添加香辛料后增大了泡菜中的微生物多樣性。

圖3 不同處理組泡菜樣本中Chao 1（a）和Shannon（b）指數(shù)Fig.3 Chao1 (a) and Shannon (b) indexes of pickles samples with different treatment groups

2.4.2 微生物群落β多樣性分析

基于Bray-Curtis距離進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）以表征兩組泡菜中細菌群落結構的相似性，結果見圖4。由圖4可知，PCoA1和PCoA2分別解釋了微生物群落結構總變異的50.43%和13.59%。除PS1樣本外，PS組各樣本聚集性較高，說明PS組中微生物群落構成差異較小。而P組中樣品間距離較遠，表明P組各樣本空間距離較大。這可能與PS組中明串珠菌占據(jù)絕對優(yōu)勢，而非優(yōu)勢菌不能大量生長有關，因此PS組中細菌種類分散度較小，且PERMANOVA 檢驗組間差異極顯著（P＜0.01），表明香辛料對泡菜中微生物菌群結構有一定影響，未添加香辛料的同一批泡菜樣本微生物群落結構差別較大，而添加香辛料可以縮小同批次中樣本間的差異，后者工藝更利于泡菜發(fā)酵體系的穩(wěn)定。

圖4 不同處理組泡菜樣本的主坐標分析結果Fig.4 Principal coordinate analysis results of pickles samples with different treatment groups

2.5 微生物群落差異性分析

2.5.1 LefSe分析及生物標志物

利用LefSe分析找到兩組泡菜樣品在豐度上有顯著差異的物種，圖5展示了LDA分值大于4.0的物種，分別作為P組和PS組的生物標志物，圖中柱形圖長度代表LDA分值的大小，長度越長，LDA分值越高，即該物種豐度對兩組間差異效果影響大。由圖5可得，LefSe分析共檢驗出前15個在兩組泡菜樣品間具有統(tǒng)計學差異的微生物類群，P組及PS組分別鑒定出10個和5個生物標志物，P組生物標志物分類到屬水平的有乳球菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬、弧菌、乳桿菌屬和Castellaniella，只有一個標志物分類到科水平（Enterobacteriaceae），其中LDA分值最高的生物標志物是來自腸桿菌科（6.13）。PS組中有4個標志物來自明串珠菌屬，剩余1個標志物分類到科水平（Enterobacteriaceae）。LDA分值最高的生物標志物來自明串珠菌屬（6.33）。

2.5.2 生物標志物與理化指標的相關性分析

為探究生物標志物與理化指標之間的聯(lián)系，繪制了生物標志物與理化參數(shù)之間的Spearman相關性熱圖見圖6。由圖6可知，P組中LactobacillusKR107058.1.1463、VibrioKF799889.1.1509、PseudomonasEU539857.1.1397、PseudomonasAF534216.1.1462和Enterobacteriaceae KC555526.1.1442均與亞硝酸鹽含量呈極顯著正相關（P＜0.01），而PS組中LeuconostocKC539103.1.1326、LeuconostocKX232108.1.1480和LeuconostocKX583579.1.1213與亞硝酸鹽含量呈極顯著負相關（P＜0.01），這解釋了表1中P組樣品中有亞硝酸鹽含量超標而PS組遠低于安全限量值的原因。P組的10個生物標志物都與總酸呈現(xiàn)負相關，其中LactobacillusKR107058.1.1463與總酸呈現(xiàn)極顯著負相關（P＜0.01），PS組的LeuconostocKX232108.1.1480與總酸呈顯著正相關（P＜0.05）；P組中6個生物標志物與pH呈顯著正相關（P＜0.05），PS組中1個生物標志物與pH呈顯著負相關（P＜0.05）。

3 結論

本研究采用高通量測序技術研究了香辛料對泡菜發(fā)酵中微生物多樣性的影響，并結合理化參數(shù)分析。其中P組優(yōu)勢菌屬為為腸桿菌、明串珠菌、乳球菌、假單胞菌、弧菌屬、乳酸桿菌屬、泛菌屬、氣單胞菌，而明串珠菌是PS組的絕對優(yōu)勢菌；PCoA分析結果表明PS組中各樣品菌群差異較小，即添加香辛料能有效提高同批次泡菜中微生物群落的穩(wěn)定性；P組中8個生物標志物與亞硝酸鹽的生成呈極顯著或顯著正相關（P＜0.01、P＜0.05），而PS組中來自明串珠菌屬的三個生物標志物與亞硝酸鹽呈極顯著負相關（P＜0.01）。本試驗結果表明，在傳統(tǒng)泡菜生產(chǎn)中添加香辛料能有效提高乳酸菌的相對豐度，使有益菌占據(jù)主導優(yōu)勢，顯著降低亞硝酸鹽含量，更能保證食用安全性。