常 馨,盧 濤,黃金昶,3△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院針灸微創(chuàng)腫瘤科,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100029;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸腫瘤研究所,北京 100029)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)最新全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示,全世界新發(fā)乳腺癌226萬例,首次超過肺癌,成為發(fā)病最多的癌種[1]。早期乳腺癌預(yù)后較好,中晚期乳腺癌仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。近年來,我國(guó)乳腺癌發(fā)病率逐年上升,并呈年輕化趨勢(shì),5年生存率為83.2%,逐步向慢性病轉(zhuǎn)變[3-5]。目前,乳腺癌治療以外科手術(shù)切除為主[6],內(nèi)科療法包括放化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等,多學(xué)科綜合治療雖然提高了患者生存率,但腫瘤治療所帶來的不良反應(yīng)亦不容小覷。

乳腺癌臨床證型以肝郁氣滯多見,疏肝解郁為基本治法,常用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散加減治療。研究表明,逍遙散聯(lián)合卡培他濱治療晚期三陰性乳腺癌可明顯提高抑瘤效果[7],進(jìn)一步系統(tǒng)綜述研究提出,逍遙散加減方聯(lián)合化療可提高乳腺癌患者實(shí)體瘤近期療效有效率[8]。丹梔逍遙散出自《內(nèi)科摘要》,是在逍遙散的基礎(chǔ)上加清瀉郁熱的牡丹皮、梔子組成,全方具有疏肝清熱、養(yǎng)血健脾的作用。乳腺癌隨著病情進(jìn)展,氣郁化火,予丹梔逍遙散疏肝健脾清熱,切中乳腺癌的基本機(jī)制[9]。此外,乳腺癌內(nèi)分泌綜合征臨床表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制類似于圍絕經(jīng)期綜合,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,而丹梔逍遙散能有效改善乳腺癌患者相關(guān)內(nèi)分泌癥狀[10]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選丹梔逍遙散有效成分,反向分子垂釣虛擬靶點(diǎn),與開源數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)匹配,獲取丹梔逍遙散治療乳腺癌的潛在作用靶點(diǎn),分析上述靶點(diǎn)前的相互作用,富集分析相關(guān)信號(hào)通路,以預(yù)測(cè)丹梔逍遙散治療乳腺癌的潛在作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP平臺(tái)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID平臺(tái)(http://www.megabionet.org/tcmid/),分別以當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、柴胡、牡丹皮、梔子、炙甘草為關(guān)鍵詞,檢索相關(guān)藥物化合物,獲取藥物相關(guān)分子信息。通過口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、類藥性(drug-likeliss,DL)篩選藥物活性成分,其中OB是指藥物進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)所占口服劑量的百分比,是關(guān)鍵的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù);DL是影響分子的藥代動(dòng)力學(xué)并最終影響這些藥物分子吸收、分布、代謝和排泄(ADME)的分子參數(shù)。由于缺乏相應(yīng)的藥理特性,中藥配方中的大多數(shù)化合物無法到達(dá)特定細(xì)胞中的作用靶點(diǎn),故本研究中認(rèn)為OB≥30%且DL≥0.18的分子具有活性。

1.2 方法

1.2.1有效化合物及作用靶點(diǎn)

利用化學(xué)相似性尋找靶點(diǎn),以TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的丹梔逍遙散中藥物活性化合物進(jìn)行靶點(diǎn)垂釣,并將獲取的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://uniprot.org/)以得到靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)名稱。

1.2.2疾病靶點(diǎn)

整合OMIM、geneCards、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù),獲取乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn),并將藥物有效成分靶點(diǎn)與乳腺癌靶點(diǎn)匹配,選取重合靶點(diǎn)作為丹梔逍遙散治療乳腺癌的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.3有效化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立

利用Cytoscape3.7.2軟件建立丹梔逍遙散有效化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),可視化丹梔逍遙散有效化合物和靶點(diǎn)信息的關(guān)系。其中有效化合物和作用靶點(diǎn)分別以“節(jié)點(diǎn)”表示,兩節(jié)點(diǎn)之間作用以“邊”表示。選取如下2項(xiàng)參數(shù)評(píng)估網(wǎng)絡(luò)特征:(1)度(degree),為節(jié)點(diǎn)的連接數(shù),反映單個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的互作頻率,度值越大,節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要;(2)中心度(betweenness centrality),為節(jié)點(diǎn)在路徑中出現(xiàn)的頻率,是反映節(jié)點(diǎn)重要性的指標(biāo),中心度越大,節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大。

1.2.4蛋白質(zhì)交互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)的建立

PPI是組成生物分子網(wǎng)絡(luò)的基本單位,也是疾病發(fā)生的關(guān)鍵步驟。本研究采用String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)獲取作用靶點(diǎn)之間的蛋白互作關(guān)系,探索丹梔逍遙散與乳腺癌的作用機(jī)制。使用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù),將物種設(shè)置為“homo sapiens”,并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件實(shí)現(xiàn)可視化。

1.2.5基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析

將篩選出的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO分析和KEGG分析。選擇物種為人(homo sapiens),篩選條件設(shè)置為:Count≥4,P≤0.01,錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)≤0.01,富集相應(yīng)的生物過程富集和信號(hào)通路。

2 結(jié) 果

2.1 丹梔逍遙散有效化合物及作用靶點(diǎn)

從TCMSP、TCMID平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得丹梔逍遙散全方每一味中草藥的活性成分,依據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、藥物相似性(drug-like properties,DL)≥0.18的標(biāo)準(zhǔn),篩選出活性成分45個(gè)(表1),藥物相關(guān)作用靶點(diǎn)204個(gè)。

2.2 乳腺癌潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過OMIM、GenCards DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得乳腺癌潛在靶點(diǎn)251個(gè)。

2.3 丹梔逍遙散治療乳腺癌潛在作用靶點(diǎn)

將丹梔逍遙散有效藥物靶點(diǎn)與乳腺癌靶點(diǎn)合并,取交集靶點(diǎn),共得到44個(gè)交集靶點(diǎn),作為丹梔逍遙散治療乳腺癌潛在作用靶點(diǎn)。以45個(gè)丹梔逍遙散有效化合物和44個(gè)作用靶點(diǎn),建立有效化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),借助Cytoscape3.7.2軟件可視化丹梔逍遙散有效化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。丹梔逍遙散有效成分主要為槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、β-胡蘿卜素、山柰酚,藥物作用靶點(diǎn)包括前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、PTGS1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、胱天蛋白酶3(caspase 3,CASP3)、B細(xì)胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,BCL2)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 2,NOS2)、細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule1,ICAM1)、CASP8等。通過上述關(guān)鍵成分與靶點(diǎn),構(gòu)成丹梔逍遙散對(duì)乳腺癌的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。

2.4 丹梔逍遙散有效化合物對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析

丹梔逍遙散有效化合物對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共有44個(gè)節(jié)點(diǎn)、550條邊,平均節(jié)點(diǎn)度為25,節(jié)點(diǎn)代表交集蛋白,邊表示蛋白之間的相互作用,邊的粗細(xì)代表蛋白間相互關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度大小。度值大于平均數(shù)的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)共30個(gè),按度值由高到低的前10位依次為白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activatedproteinkinase8,MAPK8)、CASP3、IL-10、MAPK1、CXCL8、ALB、CCL2、IL-1β、PTGS2,提示上述蛋白在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用,可能為丹梔逍遙散治療乳腺癌的核心作用靶點(diǎn)。

2.5 靶點(diǎn)通路分析

將上述44個(gè)靶點(diǎn)上傳DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO富集分析,共得到79個(gè)GO條目(P<0.05),采用P值和基因富集數(shù)量綜合過濾,獲取排名前20位的條目,丹梔逍遙散有效化合物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)富集明顯的10個(gè)生物學(xué)功能為細(xì)胞因子受體及活性、受配體活性、磷酸鹽、蛋白磷酸酶、G蛋白耦聯(lián)受體、泛素蛋白連接酶、趨化因子受體、生長(zhǎng)因子受體、趨化因子活性等,見圖1。

圖1 基因富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

獲得具有明顯意義的信號(hào)通路146條(P<0.05),采用P值和基因富集數(shù)量綜合過濾,對(duì)其進(jìn)行排序,獲取排名前20位的條目,見圖2。通路分析結(jié)果顯示,富集程度高的通路為IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)、NOD樣受體、Toll樣受體、C型凝集素受體、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1、核因子(NF)-κB等。

圖2 通路富集分析

3 討 論

乳腺癌屬于中醫(yī)“乳巖”范疇,以乳房部無痛性腫塊為主要臨床表現(xiàn),病位在乳房,與肝、脾、腎密切相關(guān)。《婦人大全良方》云:“若初起,內(nèi)結(jié)小核,或如鱉、棋子,不赤不痛。積之歲月漸大,巉巖崩破如熟石榴,或內(nèi)潰深洞,此屬肝脾郁怒,氣血虧損,名曰乳巖”。西醫(yī)普遍認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生與內(nèi)分泌失衡、晚婚晚育、不良飲食生活習(xí)慣、遺傳等因素相關(guān)。早期乳腺癌預(yù)后較好,中晚期乳腺癌臨床療效有待進(jìn)一步提高。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子垂釣技術(shù)探究了丹梔逍遙散治療乳腺癌的潛在治療機(jī)制,構(gòu)建并分析中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),表明丹梔逍遙散治療乳腺癌具有多成分、多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控特點(diǎn)。該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵活性化合物為槲皮素、木犀草素、漢黃芩素、β-胡蘿卜素、山柰酚。5種化合物均屬于黃酮類,具有類雌激素作用,其抗乳腺癌的機(jī)制主要為調(diào)節(jié)雌激素受體、抑制腫瘤細(xì)胞生成、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增敏化療、逆轉(zhuǎn)耐藥等[11-15]。

丹梔逍遙散治療乳腺癌的PPI網(wǎng)絡(luò)圖直觀反映了靶點(diǎn)間的相互作用,該網(wǎng)絡(luò)以IL-6、MAPK8、CASP3、IL-10、MAPK1、CXCL8、ALB、CCL2、IL-1β、PTGS2為核心靶點(diǎn),涉及的生物學(xué)過程包括細(xì)胞因子受體及活性、受配體活性、磷酸鹽、蛋白磷酸酶、G蛋白耦聯(lián)受體、泛素蛋白連接酶、趨化因子受體、生長(zhǎng)因子受體、趨化因子活性等。其中,IL-6、IL-10為多效細(xì)胞因子,高水平IL-6、低水平IL-10與乳腺癌進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)[16-18]。IL-6上調(diào)可促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及腫瘤干細(xì)胞更新[18],IL-10下調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移,抑制癌細(xì)胞凋亡[19],靶向調(diào)控IL-6、IL-10極有可能是未來乳腺癌的潛在治療模式。研究還表明,腫瘤微環(huán)境中骨髓來源的IL-1β通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞NF-κB和CREB信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致自分泌Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和癌癥干細(xì)胞集落形成,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,而阻斷IL-1β介導(dǎo)的信號(hào)途徑可抑制骨微環(huán)境癌癥干細(xì)胞集落形成,從而減少骨轉(zhuǎn)移[20]。MAPK8屬于細(xì)絲裂原活化蛋白激酶家族,其功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等各種機(jī)制。研究表明,MAPK8在乳腺癌中高表達(dá),其信號(hào)通路通過磷酸化癌細(xì)胞核內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn),增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性分化[21]。CASP3為級(jí)聯(lián)凋亡通路中最重要的效應(yīng)分子,與DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。癌細(xì)胞分泌趨化因子、高表達(dá)趨化因子受體,刺激炎癥反應(yīng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖遷移,增加三陰性乳腺癌紫杉醇耐藥,與乳腺癌不良預(yù)后密切相關(guān)[22]。CXCL8抑制劑或CXC趨化因子受體(CXC-chemokine receptor,CXCR)1/2抑制劑聯(lián)合其他抗腫瘤治療,可讓乳腺癌患者臨床獲益,預(yù)測(cè)靶向干預(yù)CXCL8-CXCR1/2信號(hào)軸可能是有前景的乳腺癌治療方法[23]。PTGS2高表達(dá)可能通過促血管形成、抑制免疫、影響細(xì)胞周期、增加細(xì)胞侵襲力等方式促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移,與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)[24-25]。

丹梔逍遙散治療乳腺癌的相關(guān)信號(hào)通路主要涉及IL-17、TNF、NOD樣受體、Toll樣受體、C型凝集素受體、HIF-1、NF-κB等,上述信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、凋亡、免疫功能、耐藥等密切相關(guān)?，F(xiàn)有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,丹梔逍遙散含藥血清干預(yù)后48 h,不僅可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26-27],上調(diào)自噬蛋白(Beclin1)表達(dá)以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬[28],還能調(diào)控細(xì)胞能量代謝重編程[29]。動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)提示,丹梔逍遙散低、中、高劑量均可不同程度地抑制MCF-7裸鼠移植瘤小鼠乳腺癌生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,提示其抑瘤機(jī)制可能與促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡有關(guān)[30]。丹梔逍遙散能夠下調(diào)乳腺癌移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子1α、IL-6、IL-8、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4、賴氨酰氧化酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2蛋白的表達(dá)。

本研究獲得丹梔逍遙散治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)44個(gè),KEGG通路146條,提示其作用機(jī)制涉及多靶點(diǎn)、多通路的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié),可為以后研究丹梔逍遙散多靶點(diǎn)、系統(tǒng)性干預(yù)乳腺癌的具體機(jī)制及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案優(yōu)化提供重要的理論依據(jù)。