黃吉仁,李長江,毛艷華,張文文,王 佳,謝樂樂,張應鳳

(重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 401331)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,其高發(fā)年齡集中在50歲以上,病死率居婦科惡性腫瘤首位,在女性所有腫瘤相關(guān)死亡原因中排名第五[1-3],嚴重影響女性的身心健康。目前卵巢癌的治療方案為手術(shù)+化療,但存在易復發(fā)及耐藥等問題[4]。近年來,隨著對卵巢癌發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究,靶向精準治療能有效降低復發(fā)率、提高生存率,但能接受靶向治療的人群相對局限,且亦存在復發(fā)及耐藥等問題,仍需尋找新的分子靶點[5-6]。組蛋白甲基化參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,深入研究該過程的調(diào)控有望成為卵巢癌靶向治療的新突破口[7-8]。

脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1(proline-,glutamic acid- and leucine-rich protein 1,PELP1)是多種轉(zhuǎn)錄因子及核受體的共調(diào)節(jié)劑。PELP1基因是激素依賴性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等的原癌基因[9-12]。SET結(jié)構(gòu)域分支型組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(SET domain bifurcated histone lysine methytransferase 1,SETDB1)是一種甲基轉(zhuǎn)移酶,它能夠使組蛋白H3K9位點發(fā)生甲基化,影響基因的表達,進而介導腫瘤的發(fā)生[13-14]。已有研究證實,SETDB1在肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤組織中過度表達,發(fā)揮致癌作用[15-17]。由于組蛋白修飾過程具有可逆性[18],SETDB1有望成為治療癌癥的重要靶點。LIU等[19]關(guān)于乳腺癌激素治療耐藥性形成的一項研究中證實,PELP1與SETDB1存在相互作用。本研究旨在探索PELP1、SETDB1在卵巢癌組織及卵巢癌細胞系中的表達情況,分析與患者臨床病理特征之間的聯(lián)系,初步探討兩者在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用,以期為臨床上卵巢癌患者的基因靶向治療提供新思路,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年7月至2022年5月本院婦產(chǎn)科行手術(shù)治療且臨床病理資料完整的35例卵巢癌患者組織標本,按2014年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)手術(shù)病理分期標準分為Ⅰ～Ⅱ期16例、Ⅲ～Ⅳ期19例,另選取同期收治因子宮肌瘤行子宮及雙側(cè)附件切除術(shù)的17例患者的正常卵巢組織作為對照。所有患者的組織標本均經(jīng)病理檢查明確診斷,所有患者術(shù)前均未行放化療、生物治療及內(nèi)分泌治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過(批準編號:LL-202240)。

1.2 方法

1.2.1主要試劑

RNA提取試劑 TRIzol購自寶生物工程(大連)有限公司;超微量紫外分光光度計購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司;cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 染料法熒光定量 PCR 技術(shù)檢測試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;PELP1引物(上游5′-CGG ACC AAG GTG TAT GCG ATA TT-3′,下游5′-CCA GTC TGC AAA CTC CCA TCA G-3′)、SETDB1引物(上游5′-GAA TCT TCC CGG CCT ACA GAA AT-3′,下游5′-AGA TCC TGG GAA CTG CTC TTC TT-3′)均由北京擎科生物科技有限公司合成;兔抗人SETDB1多克隆抗體、兔抗人PELP1單克隆抗體均購自英國Abcam公司;即用型SABC-POD(兔IgG)免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.2.2細胞培養(yǎng)

將卵巢癌細胞A2780(購自上海中喬新舟生物科技有限公司)、OVCAR3(購自武漢普諾賽生命科技有限公司)、SKOV3(購自武漢普諾賽生命科技有限公司)加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,正常卵巢上皮細胞IOSE80(購自上海中喬新舟生物科技有限公司)加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),胰蛋白酶消化傳代,取對數(shù)生長期細胞提取RNA。

1.2.3實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR

按TRIzol試劑說明書采用苯酚-氯仿抽提法提取細胞總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑說明書首先配制20 μL逆轉(zhuǎn)錄PCR體系,37 ℃孵育15 min,85 ℃ 5 s終止反應合成cDNA。取 4 μL cDNA 為模板,配制 20 μL實時熒光定量PCR反應體系,使用PCR 擴增儀按預變性 95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火延伸 60 ℃ 30 s,擴增 40 個循環(huán)的條件進行反應。以GADPH為內(nèi)部參照物,SETDB1和PELP1 mRNA的相對表達水平通過 2-ΔΔCt法計算得到。

1.2.4免疫組織化學

石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、水化后進行抗原熱修復,過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性后以牛血清封閉。以1 × PBS溶液配制1∶400兔抗人PELP1抗體工作液、1∶400兔抗人SETDB1抗體工作液,充分覆蓋組織切片。4 ℃ 孵育過夜。滴加生物素標記山羊抗兔IgG,37 ℃孵育30 min后滴加SABC。使用二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木素復染。結(jié)果判定根據(jù)陽性細胞所占比例及染色強度綜合評分:(1)陽性細胞所占比例評分:<10% 記0分,10%～<26%記1分,26%～<51%記2分,51%～<76%記3分,≥76%記4分;(2)染色強度評分:無著色記0分,淺黃色記1分,棕黃色記2分,棕褐色記3分。陽性細胞所占比例評分與染色強度評分相乘即為綜合評分,綜合評分 0分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8分為中度陽性(++),9～12分為強陽性(+++);以(-)～(+)判定為陰性表達,(++)～(+++)判定為陽性表達。

1.2.5觀察指標

(1)PELP1、SETDB1 mRNA在卵巢癌細胞及正常卵巢上皮細胞中的相對表達水平;(2)PELP1、SETDB1蛋白在不同卵巢組織中的陽性表達率。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 PELP1、SETDB1 mRNA的表達情況

PELP1 mRNA在卵巢癌細胞系A2780、OVCAR3、SKOV3中的表達水平分別為15.967±1.140、10.266±0.776、4.168±0.200,均高于正常卵巢細胞系IOSE80(1.004±0.090),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SETDB1 mRNA在卵巢癌細胞系A2780、OVCAR3、SKOV3中的表達水平分別為 1.720±0.071、2.232±0.271、4.157±0.016,均高于正常卵巢細胞系IOSE80(1.005±0.093),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

A:PELP1 mRNA相對表達情況;B:SETDB1 mRNA相對表達情況;a:P<0.05。

2.2 PELP1、SETDB1蛋白的表達情況

卵巢癌及正常卵巢組織大體標本見圖2。PELP1蛋白主要表達于細胞核中,其在卵巢癌組織中呈棕黃色至棕褐色陽性表達,在正常卵巢組織中呈淡黃色弱陽性或不著色陰性表達。SETDB1蛋白的表達則位于細胞質(zhì),其在卵巢癌組織中呈淡黃色弱陽性或不著色陰性表達,與正常卵巢組織無差異,見圖3。卵巢癌組織中PELP1蛋白陽性表達率高于正常卵巢組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);二者SETDB1蛋白陽性表達率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 卵巢癌組織與正常卵巢組織中PELP1、SETDB1蛋白表達情況比較[n(%)]

A:正常卵巢組織;B:卵巢癌組織。

A:正常卵巢組織中PELP1蛋白表達情況;B:卵巢癌組織中PELP1蛋白表達情況;C:正常卵巢組織中SETDB1蛋白表達情況;D:卵巢癌組織中SETDB1蛋白表達情況。

2.3 PELP1、SETDB1蛋白表達與臨床病理特征間的關(guān)系

基于卵巢癌的高發(fā)病年齡多集中在50歲以上,根據(jù)患者年齡是否>50歲將其分為兩組,分析卵巢癌組織中PELP1、SETDB1蛋白表達情況與相應患者臨床病理資料之間的相關(guān)性。結(jié)果表明,不同F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的PELP1蛋白陽性表達比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 PELP1、SETDB1蛋白表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

隨著對卵巢癌認識和研究的不斷深入、診療水平的不斷提升,卵巢癌患者的預后逐漸得到改善,但其病死率仍常年居于婦科腫瘤首位[20]。近年來,靶向治療成為有效降低卵巢癌復發(fā)率、提高患者生存率的治療措施[21]。目前,靶向藥物主要包括抗血管生成藥物、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑及免疫檢查點抑制劑等,但其獲益人群相對有限,也存在耐藥、骨髓抑制等問題,仍需繼續(xù)尋找新的分子靶點[5-6]。

近年來,表觀遺傳調(diào)控在癌癥發(fā)生、發(fā)展中的作用得到了廣泛研究。PELP1是一種支架蛋白及多種轉(zhuǎn)錄因子、核受體的共調(diào)節(jié)劑,通過其N-末端包含的LXXLL基序或C-末端富含谷氨酸的區(qū)域與多種轉(zhuǎn)錄因子及核受體的相應結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用,進而發(fā)揮其生物學效應[9]。PELP1基因定位于17p13.2,編碼長度為1 130個氨基酸組成的蛋白,表達于人腦、睪丸、卵巢及子宮等部位[22-23]。研究表明,PELP1是激素依賴性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的原癌基因,此外,在激素非依賴性腫瘤如腦腫瘤、肺癌和結(jié)直腸癌中亦有作用[24-25]。目前,PELP1在卵巢癌中的臨床價值尚不清楚,本研究表明,相較于正常卵巢組織,卵巢癌組織中PELP1蛋白的表達水平明顯升高,此外PELP1 mRNA在幾種卵巢癌細胞中的表達也明顯高于正常卵巢細胞。分析其與患者臨床病理特征的聯(lián)系,發(fā)現(xiàn)不同F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的PELP1蛋白陽性表達比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此推測PELP1可能是一種重要的促癌蛋白,在卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到一定的促進作用。

組蛋白甲基化是常見的表觀遺傳修飾之一,此過程可由甲基轉(zhuǎn)移酶介導。SETDB1由1 291個氨基酸組成,其編碼基因位于1q21.3,長度為50 000 bp[14],表達于人的睪丸、卵巢、闌尾及腦組織等部位。SETDB1可催化組蛋白H3上的賴氨酸9殘基發(fā)生二甲基化或三甲基化,加重染色質(zhì)的致密程度,DNA纏繞于組蛋白上組成染色質(zhì),其致密程度加重后使得該部位的DNA轉(zhuǎn)錄過程變得更難,進而影響基因的表達[14]。研究表明,SETDB1參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[26]。由于SETDB1引起原癌基因或抑癌基因沉默或轉(zhuǎn)錄抑制的不確定性,使得其在某些組織中表現(xiàn)為腫瘤抑制作用,在另外一些組織中表現(xiàn)為腫瘤促進作用。

LIU等[19]關(guān)于乳腺癌激素治療耐藥性形成的一項研究中證實了PELP1對SETDB1介導的蛋白激酶B(Akt)激活至關(guān)重要,但PELP1是否能夠調(diào)節(jié)SETDB1介導的其他生物學功能,如表觀遺傳修飾、p53信號通路傳導、細胞周期調(diào)控、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤轉(zhuǎn)移等,仍有待進一步研究。王巍等[16]、董紅玲[17]的研究結(jié)果表明,SETDB1在卵巢癌組織及卵巢癌細胞中均呈高表達,并能促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移,與患者的不良預后密切相關(guān)。本研究與上述兩位學者的研究結(jié)果有所不同的是,相較于正常卵巢組織,SETDB1蛋白在卵巢癌組織中的表達并無明顯差異,但SETDB1 mRNA表達水平在幾種卵巢癌細胞系中相較于正常卵巢細胞系明顯升高,故SETDB1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中是否起到作用仍需深入研究。本研究表明PELP1與SETDB1 mRNA表達水平在幾種卵巢癌細胞系中均明顯升高,PELP1蛋白在卵巢癌組織中呈高表達,SETDB1蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中的表達無明顯差異,結(jié)合文獻推測PELP1能參與調(diào)節(jié)SETDB1的表觀遺傳修飾功能,并可能作用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后翻譯過程,負性調(diào)控SETDB1蛋白的表達,使得原癌基因組蛋白H3K9位點甲基化程度減弱,染色質(zhì)的致密性程度減弱,轉(zhuǎn)錄活性增強,進而促進卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。

目前,國內(nèi)外關(guān)于PELP1、SETDB1在卵巢癌中的研究鮮有報道,在卵巢癌中,PELP1是否能夠調(diào)節(jié)SETDB1蛋白的表達、是否參與SETDB1的表觀遺傳修飾過程,以及SETDB1介導的組蛋白甲基化這一表觀遺傳修飾過程在不同組織中對不同基因是否具有選擇性等問題仍需深入研究。在后期的研究中,本課題組擬擴大樣本量,進一步驗證SETDB1基因在卵巢癌組織中的表達情況。預期的研究結(jié)論為,PELP1與SETDB1在卵巢癌組織及卵巢癌細胞中均高表達,并可促進卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力,PELP1蛋白與SETDB1蛋白存在相互作用,PELP1參與調(diào)控SETDB1的表觀遺傳修飾過程,并進一步影響基因的表達。

與基因組變異不同,組蛋白甲基化作為一種表觀遺傳調(diào)控方式,其過程是可逆的,因此,從逆轉(zhuǎn)表觀遺傳修飾的角度著手,如通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶-去甲基化酶動態(tài)調(diào)節(jié)組蛋白甲基化過程,靶向逆轉(zhuǎn)異常的基因表達,可能為卵巢癌的治療提供一種新的思路。

綜上所述,PELP1基因在卵巢癌組織及卵巢癌細胞中均呈高表達,其在卵巢癌中可能發(fā)揮了重要的促癌作用。此外,PELP1可能對SETDB1有一定的調(diào)控作用,兩者有望成為卵巢癌靶向治療的新突破口。