李 雯,劉婭欽,路 蘋,萬自芬,張湘燕,趙 丹△

(1.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,貴陽550002;2.國家衛(wèi)生健康委員會肺臟免疫性疾病重點實驗室,貴陽 550000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是臨床常見的綜合征,目前普遍認為OSAHS是一種全身性疾病,可致多器官損害,其是高血壓的致病因素,也是糖尿病、中風、缺血性心肌病、心力衰竭、心律失常等疾病的獨立危險因素[1]。慢性間歇性低氧(chronic intermittent hyoxia,CIH)是OSAHS特有的病理生理改變,可導致氧化應激、炎癥、交感神經(jīng)過敏和內(nèi)皮功能障礙[2]。OSAHS發(fā)生并發(fā)癥病因的中心因素是氧化應激和炎癥反應。動物模型顯示,氧化應激和炎癥反應增加活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),其可通過相關(guān)酶類的激活及磷酸化過程活化核因子-κB(NF-κB),后者將導致其下游大量促炎因子、黏附因子表達增強,激活單核細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞等引起內(nèi)皮功能受損和多系統(tǒng)疾病[3]。腸道菌群作為人或動物的“共生體”,可以輔助宿主進行營養(yǎng)吸收和能量代謝[4]。正常情況下腸道菌群與機體處于平衡狀態(tài),通過腸道屏障將腸腔內(nèi)存在的大量細菌及毒素和機體內(nèi)環(huán)境分隔開,避免了細菌的滯留和移位,正常腸道內(nèi)的細菌及內(nèi)毒素并不致病。當由于各種原因打破這種平衡時,腸道屏障破壞,導致細菌發(fā)生結(jié)構(gòu)、功能變化或空間上的轉(zhuǎn)移,從而引發(fā)機體疾病。腸道黏膜在正常情況下處于高灌注狀態(tài),對缺血、缺氧極其敏感,無論是機體整體還是腸道缺血、缺氧都會直接損傷腸道黏膜,進一步影響腸道微生物的定殖[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),長期處于CIH狀態(tài)下會引起腸道菌群改變、血糖調(diào)節(jié)紊亂,但其機制仍不清楚[6-7]。因此,本研究探討CIH對大鼠腸道菌群與血糖的作用機制,以期為改善患者預后提供潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取健康雄性SD大鼠30只,6周齡,體重180～220 g,購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司。

1.2 主要試劑

大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)、血糖、胰島素(INS)的ELISA試劑盒購自上海研輝生物科技有限公司,NF-κB抗體兔多抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。純氮氣購自貴州省安順市特種氣體有限公司。

1.3 方法

1.3.1模型制作及分組

SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組(NC組)、CIH 4周組(CIH4組)、CIH 8周組(CIH8組),每組10只。誘導CIH模型:向艙內(nèi)循環(huán)充入氮氣(純度>99.9%)和空氣,氧氣分析儀持續(xù)檢測低氧艙內(nèi)氧氣濃度,確保低氧艙內(nèi)氧氣濃度維持在7%～21%;充入氮氣使得低氧艙氧氣濃度維持在7%,持續(xù)時間30 s,恢復氧濃度21%,持續(xù)時間90 s,每次循環(huán)2 min[4]。CIH大鼠每天結(jié)束實驗后將實驗動物取出,放入飼養(yǎng)箱內(nèi)自由飲水與攝食,飼養(yǎng)條件及生活環(huán)境與NC組相同,實驗過程中CIH8組大鼠死亡2只。分別在實驗第4周結(jié)束時留取CIH4組大鼠糞便,實驗第8周結(jié)束時留取CIH8組、NC組大鼠糞便。糞便采集方法:75%乙醇連續(xù)3次消毒大鼠肛周皮膚刺激大鼠排便,滅菌鑷子從大鼠肛門部取出糞便放入無菌EP管中-80 ℃冰箱保存。第4、8周結(jié)束實驗時,于清晨保持空腹狀態(tài),100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射進行常規(guī)麻醉大鼠,經(jīng)股動脈采血并處死大鼠,立即暴露胰腺組織及腸道組織并做好分離,室溫下4%多聚甲醛固定24 h。暴露腸道,尋找回盲部,摘取部分小腸段及大腸起始段,清水沖洗多次直至腸道無糞便殘渣,放入無菌EP管中-80 ℃冰箱保存。離心血標本(3 000 r/min,離心15 min),留取上清液。

1.3.2檢測大鼠血清中TNF-α、LPS、INS及空腹血糖(FBG)水平

采用ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF-α、LPS、INS及FBG水平,具體步驟參照試劑盒說明書。采用穩(wěn)態(tài)模型法計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)。

1.3.3高通量測序

通過干冰將大鼠糞便轉(zhuǎn)運至深圳微科服技術(shù)有限公司,后續(xù)大鼠腸道菌群測序工作交由該公司進行。根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(杭州西頓生物科技有限公司)對大鼠腸道樣品進行DNA抽提,NanoDrop2000對DNA濃度和純度進行檢測,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量;338上游引物5′-ACT CCT ACG GGA GGA GCA G-3′和8806下游引物5′-GGA CTA CHV GGG TWT CAA T-3′對V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美國Axygen公司)進行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司進行定量檢測。根據(jù)IlluminaMiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE300的文庫,美國Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序。

1.3.4大鼠胰腺、腸道組織病理學改變及NF-κB表達

胰腺、腸道組織制作石蠟切片和蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察病理學改變。免疫組化測定大鼠胰腺、腸道組織NF-κB表達。復水,抗原修復,3%過氧化氫室溫下孵育,加入NF-κBp65兔抗人單克隆抗體和生物素二抗,DAB顯色,復染脫水,中性樹膠封片固定、晾干后高倍視野顯微鏡下觀察,成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件分析,結(jié)果表示為目標蛋白的平均光密度。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清中FBG、LPS、INS、HOMA-IR、TNF-α水平比較

CIH4、CIH8組血清中FBG、LPS、HOMA-IR、TNF-α水平均高于NC組(P<0.05),且CIH8組變化更明顯(P<0.05)。CIH8組大鼠INS水平均高于NC、CIH4組(P<0.05),但NC組與CIH4組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠血清中FBG、INS、HOMA-IR、LPS、TNF-α水平比較

2.2 各組大鼠腸道菌群種類及豐度表達

CIH大鼠腸道菌群門水平相對豐度主要集中在放線菌門、變形菌門,而NC組大鼠腸道菌群門水平相對豐度主要集中在厚壁菌門和擬桿菌門。CIH大鼠腸道菌群在屬水平隨著低氧時間的延長未指明的梭菌目細菌、瘤胃球菌屬細菌、未指明消化鏈球菌科細菌、密螺旋體屬細菌、擬桿菌屬細菌、蘇黎世桿菌屬細菌及棒狀桿菌屬細菌的相對豐度增加,乳酸菌屬細菌及普雷沃菌屬細菌的相對豐度減少,NC組大鼠腸道菌群屬水平相對豐度主要集中在乳酸菌屬細菌和普雷沃菌屬細菌。

2.3 各組大鼠胰腺和腸道組織病理學改變及NF-κB表達

NC組大鼠胰腺組織少量胰腺腺泡胞質(zhì)疏松,胞核居中,與周圍細胞產(chǎn)生間隔;有的胰島細胞胞質(zhì)疏松,未見明顯炎性細胞浸潤。間歇性低氧可導致大鼠胰腺組織腺體杯狀細胞消失,有的地方可見腺體脫落,殘留基底組織。NC組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,有的地方可見腺體脫落,固有層少許炎性細胞浸潤。間歇性低氧可導致大鼠腸道組織廣泛黏膜糜爛,上皮細胞脫落,腺體杯狀細胞消失,有的地方可見腺體脫落,殘留基底組織,固有層廣泛可見較多炎性細胞浸潤,見圖1。

CIH8組胰腺和腸道組織中NF-κBp65表達高于NC組(P<0.05),其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2、表2。

圖2 各組大鼠胰腺和腸道組織免疫組化檢測(200×)

表2 各組不同組織中NF-κBp65表達比較

3 討 論

CIH是OSAHS最具特征性的病理生理改變,長期間歇性低氧狀態(tài)誘發(fā)機體的氧化應激被認為是OSAHS引起多系統(tǒng)并發(fā)癥的最重要機制。OSAHS由于反復發(fā)生低氧、復氧過程,可能引起類似缺血-再灌注的病理生理改變,產(chǎn)生大量ROS,進一步激活炎癥因子,引起全身炎癥反應[8]。人或動物的腸道黏膜處于高灌注狀態(tài),因此對缺血、缺氧十分敏感。機體整體或腸道缺血、缺氧的狀態(tài)會直接損傷腸道黏膜系統(tǒng),導致腸道菌群發(fā)生改變、菌群移位[9-11]。腸道菌群主要位于結(jié)腸,機體內(nèi)外環(huán)境破壞均可導致腸道菌群紊亂[12]。CIH小鼠在全身炎癥因子水平升高的情況下,腸道菌群發(fā)生明顯改變,特別是擬桿菌屬、脫硫弧菌科增多,雙歧桿菌屬減少。有研究表明,腸道菌群發(fā)酵后的主要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)如乙酸、丙酸、丁酸等參與調(diào)節(jié)機體代謝、腸道免疫及炎癥反應[13]。腸道免疫系統(tǒng)通過腸道微生物與先天性免疫系統(tǒng)的Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)的相互作用引發(fā)免疫信號,TLR可通過相關(guān)信號通路激活NF-κB途徑參與腸道的炎癥反應[14-15]。而腸道菌群紊亂可通過引發(fā)機體慢性炎癥、代謝紊亂、改變SCFA等途徑進一步促成糖尿病的發(fā)生、發(fā)展[14]。NF-κB是哺乳動物的一種多效性轉(zhuǎn)錄因子,受氧化應激、LPS、細胞因子等多種刺激而活化,有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB是介導OSAHS炎癥反應的重要轉(zhuǎn)錄因子[5]。機體在一般情況下NF-κB處于失活狀態(tài),CIH引起類似缺血-再灌注損傷的病理改變,產(chǎn)生大量ROS,激活相關(guān)信號通路和NF-κB途徑,進而啟動基因的轉(zhuǎn)錄,使得下游的炎癥相關(guān)因子如白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、TNF-α等表達增加[16],引起血管內(nèi)皮功能損傷。有研究證實,LPS可通過CD14/Toll受體通路激活NF-κB,進入細胞核后與DNA結(jié)合,從而啟動炎性因子TNF-α、IL-6等的表達,引發(fā)機體慢性炎癥反應和代謝紊亂[17]。有臨床試驗研究將中重度OSAHS患者與健康對照進行比較,分別檢測氧化應激相關(guān)指標及炎癥因子水平,3個月后重復檢測上述指標,發(fā)現(xiàn)中重度OSAHS患者氧化應激相關(guān)指標及炎癥因子水平明顯升高[18]。有實驗研究把大鼠至于間歇性低氧環(huán)境下生存4周,發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下大鼠的IL-6、TNF-α明顯升高[19]。有研究指出,氧化應激和炎癥反應使得機體產(chǎn)生大量的ROS,其具有細胞毒性,可通過多種途徑促進胰島β細胞凋亡,直接導致胰腺細胞功能受損[20]。機體為適應環(huán)境,大量表達炎癥因子,其中NF-κB由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核,激活細胞炎性轉(zhuǎn)導通路,TNF-α、IL-6等炎性因子增加。TNF-α可誘導胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和INS受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)的絲氨酸磷酸化水平升高,而抑制正常的酪氨酸磷酸化,使INS受體與底物結(jié)合降低,信號傳導受抑制,INS不能發(fā)揮正常作用[21]。此外,TNF-α通過蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2C)的轉(zhuǎn)錄上調(diào),關(guān)鍵能量傳感器AMP依賴的蛋白激酶失活來抑制INS敏感性[22]。有研究顯示[23-24],小鼠皮下注射LPS 4周后血糖升高、糖耐量異常,并出現(xiàn)了IR等。PANOUTSOPOULOS等[25]發(fā)現(xiàn),給予OSAHS患者持續(xù)氣道正壓通氣(continues the positive pressure to ventilate,CPAP)治療后,體內(nèi)高水平的CRP及IL-6等明顯下降,IR緩解。有研究提示,短期的CPAP治療能夠降低睡眠期間或全天的血糖水平,改善IR[26]。動物實驗發(fā)現(xiàn),低氧能造成腸道菌群改變,從而增加腸道通透性,改變血漿外泌體,誘導脂肪細胞功能障礙,致使IR增加;已有動物實驗證實,將OSAHS小鼠糞便微生物轉(zhuǎn)移至受體小鼠后,出現(xiàn)了IR[27-28]。因此,OSAHS引起的腸道菌群失調(diào)可以導致IR。本實驗通過模擬OSAHS的間歇低氧狀態(tài),建立CIH大鼠模型,進一步驗證了其可引起腸道菌群失調(diào),體內(nèi)炎癥因子水平發(fā)生改變,LPS、TNF-α、NF-κB水平升高,腸道組織和部分胰腺組織腺體破壞,血糖水平改變,為OSAHS合并糖尿病患者的防治提供了新思路。