馮 靜,吳友良,陳 霞,楊 艷,向 萍,劉富春

(陸軍第九五八醫(yī)院兒科,重慶 400020)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一種死亡率高達(dá)40%～70%的肺部炎癥性疾病,現(xiàn)有臨床治療措施有限且療效較差。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因具備組織損傷修復(fù)、免疫調(diào)控等功能,在ALI/ARDS治療方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的治療潛力[1],但部分臨床研究也發(fā)現(xiàn)單獨MSCs移植效果尚未達(dá)到臨床治愈標(biāo)準(zhǔn),在減少肺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡等方面存在不足[2]。如何提高M(jìn)SCs修復(fù)功能將成為促進(jìn)其未來臨床推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。本課題組前期證實了MSCs可修復(fù)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的ALI細(xì)胞模型中肺上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells,AEC)損傷。最新研究已發(fā)現(xiàn),機(jī)體出現(xiàn)ALI的關(guān)鍵機(jī)制之一在于體內(nèi)的活性氧產(chǎn)生增加,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加速,而MEK1/2特異性抑制劑(UO126)能有效抑制細(xì)胞氧化損傷[3]。因此本研究首先采用LPS誘導(dǎo)AEC損傷,然后將UO126加入AEC和MSCs共培養(yǎng)液中,探索UO126在MSCs干預(yù)LPS誘導(dǎo)ALI細(xì)胞模型中的作用,為提高M(jìn)SCs移植療效提供新舉措,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞

人正常肺上皮細(xì)胞株和骨髓MSCs購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要試劑

線粒體膜電位測定試劑盒、CCK-8檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司,細(xì)胞腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、caspase-1活性檢測試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司,特級胎牛血清購自美國Clark Bioscience公司,UO126購自北京百奧萊博科技有限公司,融合蛋白1 (Mitofusin 1,MFN1)、線粒體RhoGTP酶1(mitochondrial Rho-GTPase 1,Miro1)、核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear respiratory factor,NRF1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactiva-tor-1,PGC-1α)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)ELISA檢測試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1實驗分組

實驗分成AEC組、AEC+LPS組、AEC+LPS+MSCs組、AEC+LPS+MSCs+UO126(配制濃度為0.3 nmol/L)組。UO126配制濃度根據(jù)前期實驗及RAHMAN等[4]研究。

1.2.2LPS誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷模型的建立

取AEC 5×106/mL接種于6孔板DEME培養(yǎng)液中,根據(jù)既往課題組研究加入10 μg/mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng),建立ALI細(xì)胞模型。

1.2.3AEC和MSCs共培養(yǎng)

AEC培養(yǎng)液中加入10 μg/mL LPS,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。取MSCs懸液500 μL,細(xì)胞密度5×106/mL直接加入AEC培養(yǎng)瓶中,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。

1.2.4流式細(xì)胞分選術(shù)

無菌條件下采用流式細(xì)胞分選術(shù),將混合共培養(yǎng)AEC和MSCs相互分離。利用增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的標(biāo)記將其中陰性表達(dá)的上皮細(xì)胞群進(jìn)一步分選,將分選出的細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)激光共聚焦顯微鏡下觀察,證實分選出的細(xì)胞為EGFP陰性,且呈現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特征性的大小均一的短梭形狀。分選出的用于后續(xù)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活性分析等實驗。

1.2.5CCK-8 測定

檢測加入UO126 48 h后對AEC及共培養(yǎng)細(xì)胞活力的影響。在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μL/孔),將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(在37 ℃,5% CO2的條件下),向每孔加入10 μL的CCK-8溶液,繼續(xù)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～4 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A)值。

1.2.6線粒體膜電位的測定

把配制好的JC-1染色工作液用JC-1染色緩沖液稀釋5倍,加入0.2 mL總蛋白量為100 μg純化的線粒體,用熒光分光光度計檢測。

1.2.7細(xì)胞ATP測定

加100 μL ATP檢測工作液到檢測孔或檢測管內(nèi)。在檢測孔或檢測管內(nèi)加上20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品,迅速用槍(微量移液器)混勻,至少間隔2 s后,用光度計或液閃儀測定相對光單位(relative light unit,RLU)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中ATP的濃度。

1.2.8TUNEL檢測細(xì)胞凋亡

免疫染色固定液(P0098)固定細(xì)胞30 min,再加入免疫染色強(qiáng)力通透液(P0097)室溫孵育5 min。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并計算凋亡率。

1.2.9caspase-1活性檢測

用按照每200萬細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液,重懸沉淀,冰浴裂解15 min。把上清液轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)冷的離心管中,立即測定caspase-1的酶活性或-70 ℃保存樣品。

1.2.10線粒體相關(guān)蛋白水平測定

采用生物素耦聯(lián)抗體作為檢測抗體,依次將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品和生物素耦聯(lián)檢測抗體加入孔中,用洗滌液洗去未結(jié)合的成分。加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)-鏈霉親和素,用洗滌液洗去未結(jié)合的偶聯(lián)物。再將四甲基聯(lián)苯胺(trimethylbenzene,TMB)底物溶液添加到每個孔中進(jìn)行顯色。通過添加硫酸溶液終止酶-底物反應(yīng),并通過分光光度法在450 nm 的波長處測定A值,通過曲線軟件方程計算蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量比較

鏡下可見AEC組細(xì)胞貼壁生長,呈梭形、扁平立方形、多角形等多種形態(tài)生長,以梭形最為常見,AEC+LPS組細(xì)胞數(shù)量減少。AEC+LPS+MSCs組可見呈短梭形、三角形或多邊形生長的MSCs,AEC+LPS+MSCs+UO126組兩種細(xì)胞均可見,數(shù)量較AEC+LPS+MSCs組增加,見圖1。

2.2 各組細(xì)胞活力比較

AEC+LPS組細(xì)胞活力較AEC組降低,而AEC+LPS+MSCs組細(xì)胞活力較AEC+LPS組升高,AEC+LPS+MSCs+UO126組較AEC+LPS+MSCs組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

a:P<0.05。

2.3 各組線粒體膜電位比較

AEC+LPS組線粒體膜電位較AEC組降低,而AEC+LPS+MSCs組線粒體膜電位較AEC+LPS組升高,AEC+LPS+MSCs+UO126組較AEC+LPS+MSCs組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

a:P<0.05。

2.4 各組ATP值比較

AEC+LPS組ATP值較AEC組降低,而AEC+LPS+MSCs組ATP值較AEC+LPS組升高,AEC+LPS+MSCs+UO126組較AEC+LPS+MSCs組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

a:P<0.05。

2.5 各組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

AEC+LPS組細(xì)胞凋亡指數(shù)較AEC組升高,而AEC+LPS+MSCs組細(xì)胞凋亡指數(shù)較AEC+LPS組降低,AEC+LPS+MSCs+UO126組較AEC+LPS+MSCs組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

a:P<0.05。

2.6 各組caspase-1活性比較

AEC+LPS組caspase-1活性較AEC組升高,而AEC+LPS+MSCs組caspase-1活性較AEC+LPS組降低,AEC+LPS+MSCs+UO126組較AEC+LPS+MSCs組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

a:P<0.05。

2.7 各組細(xì)胞培養(yǎng)液線粒體蛋白水平比較

AEC+LPS組MFN1、Miro1、NRF1、PGC-1α、TFAM水平較AEC組降低,而AEC+LPS+MSCs組MFN1、Miro1、NRF1、PGC-1α、TFAM水平較AEC+LPS組升高,AEC+LPS+MSCs+UO126組Miro1、TFAM水平較AEC+LPS+MSCs組升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

A:MFN1蛋白水平比較;B:Miro1蛋白水平比較;C:NRF1蛋白水平比較;D:PGC-1α蛋白水平比較;E:TFAM蛋白水平比較;a:P<0.05。

3 討 論

ALI常見病理表現(xiàn)為彌漫性 AEC損傷,導(dǎo)致 AEC的過度炎癥和凋亡,肺部持續(xù)性和重復(fù)性損傷可導(dǎo)致肺纖維化,形成不可逆的、嚴(yán)重呼吸功能損傷[5]。 由于現(xiàn)有治療藥物的藥代動力學(xué)研究不足、個體差異性等多種因素,目前仍缺乏有效的ALI治療藥物。國內(nèi)外學(xué)者為探求ALI新治療措施,開展大量動物或細(xì)胞模型研究,其中LPS作為重要的炎癥誘導(dǎo)物被廣泛應(yīng)用[6]。近年來開展的有關(guān)ALI臨床創(chuàng)新研究中,MSCs移植已被證實是一種極具有潛力的治療手段。MSCs不僅有免疫及替代作用,且分泌的外泌體可介導(dǎo)miR-23a-3p和miR-182-5p通過抑制B細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子抑制因子激酶ε(Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells kinase epsilon,Ikbkb)和破壞kappa B 抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)β來抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和hedgehog通路,逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的肺損傷和纖維化的進(jìn)展[7]。但越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)單獨MSCs移植療效不穩(wěn)定,對受損的AEC修復(fù)效果尚不足,分化細(xì)胞的活力及線粒體功能等不能取代受損組織,而免疫調(diào)節(jié)作用可能為MSCs治療ALI的關(guān)鍵作用機(jī)制之一。因此臨床上需要反復(fù)多次輸注細(xì)胞,這就導(dǎo)致ALI恢復(fù)時間延長、臨床推廣困難等問題,因此探討提高M(jìn)SCs移植療效加強(qiáng)保護(hù)功能的新措施逐漸成為近年關(guān)注熱點之一[8]。

研究證實細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號級聯(lián)參與了肺損傷的炎癥反應(yīng)。ERK上游激酶MEK1/2的特異性抑制劑——UO126在體內(nèi)和體外均能抑制ERK的磷酸化。多種動物疾病模型已明確,UO126可以部分通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞反應(yīng)來減少有害的炎癥反應(yīng)[9]。兩種肺損傷小鼠模型包括LPS誘導(dǎo)和銅綠假單胞菌感染的細(xì)菌性肺炎模型均證實,通過藥物抑制 MEK1/2信號途徑可以增強(qiáng)體內(nèi)白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4/IL-13應(yīng)答基因表達(dá),24～72 h后小鼠活力增加,更快恢復(fù)體重,肺中性粒細(xì)胞減少,巨噬細(xì)胞M2極化增強(qiáng)。進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激新鮮分離的人外周血單個核細(xì)胞,UO126可劑量依賴性地阻斷IL-2和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)的釋放[10]。早期研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠模型中,支氣管肺泡灌洗液可見大量的中性粒細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子[11]。如果使用 UO126預(yù)處理小鼠可明顯減少肺泡中性粒細(xì)胞水平,降低支氣管肺泡液中TNF-α、趨化性的巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2和KC水平[12]。UO126還可以降低支氣管肺泡灌洗液中的血管滲漏的標(biāo)志——白蛋白水平[13],減少機(jī)體游離脂肪酸誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞及其胞外誘捕網(wǎng)產(chǎn)生[3]。 肺組織學(xué)檢查顯示,使用 UO126通過抑制MEK1/2,可有效減弱LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)。這些研究均表明UO126可能成為提高M(jìn)SCs移植療效的措施之一。

本研究首先根據(jù)前期研究結(jié)果及RAHMAN等[4]研究,發(fā)現(xiàn)LPS對AEC細(xì)胞活力、ATP值、線粒體蛋白水平均有明顯影響,而MSCs可明顯降低LPS誘導(dǎo)的AEC細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-1活性,提高線粒體膜電位、ATP值。隨之將UO126加入LPS刺激下的AEC與MSCs共培養(yǎng)板中,發(fā)現(xiàn)UO126可進(jìn)一步降低共培養(yǎng)組AEC 的caspase-1活性及細(xì)胞凋亡指數(shù),提高線粒體膜電位、ATP值。因此,UO126可以明顯提高M(jìn)SC對LPS誘導(dǎo)下AEC損傷的保護(hù)作用,但其可能的作用途徑尚不清楚,需進(jìn)一步的探索。

近年研究表明,UO126可以影響線粒體生物能學(xué)[14-15]。在一項代謝分析測量中發(fā)現(xiàn)UO126可以影響還原型輔酶Ⅰ[nicotinamide adenine dinucleotide,NAD(H)]的實時氧化狀態(tài)、電子傳遞鏈的血紅素和完整的活細(xì)胞內(nèi)的氧消耗,即使結(jié)構(gòu)不同的MEK1/2抑制劑對線粒體代謝有直接的、劑量依賴的影響[16]。UO126引起NAD(H)還原、血紅素氧化和耗氧量降低,具有復(fù)合物Ⅰ抑制特性[17-18]。另有研究證實UO126作用是與代謝密切相關(guān),而對代謝的影響是隨著線粒體調(diào)控而不是MEK1/2的抑制而發(fā)生的[19-20]。因此,UO126提高M(jìn)SCs治療療效可能與調(diào)控細(xì)胞線粒體功能有關(guān),故本研究主要測定了各組細(xì)胞培養(yǎng)液中維持線粒體的運動、形態(tài)、能量代謝都具有重要意義的MFN1、Miro1、NRF1、PGC-1α、TFAM水平。MFN1線粒體融合必需的分子,介導(dǎo)線粒體外膜融合[21]。Miro1作為線粒體外膜的GTPase家族成員,是線粒體移動相關(guān)的重要蛋白,與線粒體的運動功能密切相關(guān)[22]。NRF1、TFAM是調(diào)控線粒體基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)的因子[23]。PGC-1α作為線粒體生物合成路徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),影響能量代謝和線粒體生物發(fā)生等諸多方面[24-25]。從實驗中可以看出LPS可明顯抑制AEC線粒體融合、合成、呼吸、移動等功能,而MSCs可有效減弱這種抑制作用。UO126可能通過抑制MEK1/2活性,干預(yù)LPS誘導(dǎo)下共培養(yǎng)中細(xì)胞線粒體的Miro1及TFAM水平,尤其對Miro1水平影響更為明顯(P<0.05)。由此可見,UO126可能通過提高LPS刺激下細(xì)胞線粒體移動功能增強(qiáng)MSCs的修復(fù)作用,但對細(xì)胞線粒體融合、合成功能作用較弱。

綜上所述,UO126可有效增強(qiáng)MSCs保護(hù)功能減少LPS誘導(dǎo)下AEC損傷,降低AEC凋亡,提高細(xì)胞活力及線粒體合成ATP,此作用可能與調(diào)控MSCs與AEC間線粒體功能有關(guān)。本研究為臨床提高M(jìn)SCs移植治療肺損傷療效,減少氧化損傷,減輕細(xì)胞凋亡提供了新策略,且提出調(diào)節(jié)MSCs線粒體功能尤其是線粒體移動功能可能是治療ALI的關(guān)鍵,今后本課題組也將對UO126干預(yù)MSCs線粒體功能的機(jī)制進(jìn)行深入探索。