杜沅沁， 王萌， 黃國初， 姚春， 鐘瑞熙， 黃良江， 徐健， 黃晶晶， 譚欽文，毛德文

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院， 南寧 530000； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科， 南寧 530023

肝性腦?。℉E）是一種常見且公認(rèn)的肝病神經(jīng)精神綜合征，其特征是在沒有其他已知腦部疾病的情況下出現(xiàn)一系列神經(jīng)精神癥狀［1］。臨床上，患有肝病且出現(xiàn)上述嚴(yán)重癥狀的患者可診斷為顯性HE。然而，30%～70%的肝硬化患者沒有表現(xiàn)出任何臨床上明顯的腦功能障礙癥狀，但在神經(jīng)心理、生理測試或腦電圖中取得了異常結(jié)果［2］。僅表現(xiàn)為輕度癥狀包括認(rèn)知和注意力缺陷、反應(yīng)遲鈍、記憶減退以及視覺運動協(xié)調(diào)障礙，這種情況定義為輕微型肝性腦?。∕HE）［3］，是進(jìn)展為顯性HE的高危風(fēng)險因素，無疑將增加此類患者的救治難度與死亡風(fēng)險［4］。因此，通過對MHE發(fā)病機(jī)制的深入了解，MHE的診斷和預(yù)防對于降低HE的發(fā)病率和病死率變得越來越重要。MHE發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明。一般認(rèn)為MHE是顯性HE的特殊類型，屬HE的早期階段，其機(jī)制與顯性HE一致，只在程度存在差別。氨中毒學(xué)說是最早提出且證據(jù)最多的發(fā)病機(jī)制假說，氨代謝紊亂引起氨中毒可觸發(fā)神經(jīng)元凋亡級聯(lián)反應(yīng)［5］。損害顱內(nèi)血流的自動調(diào)節(jié)功能［6］，直接影響腦部神經(jīng)生理功能。除此之外尚有γ-氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)與假性神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說，二者均可產(chǎn)生中樞抑制效應(yīng)，表現(xiàn)出神經(jīng)功能異常變化［7-8］。最近一項研究［9］表明，腦內(nèi)膽固醇蓄積是通過膽汁酸（bile acid，BA）介導(dǎo)的法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）作用促進(jìn)MHE進(jìn)展的一個因素。

中醫(yī)藥由于其獨特的理論體系、指導(dǎo)方針和用藥方法，在治療和預(yù)防疾病中發(fā)揮著重要的作用［10］。腸道微生物群通過生物轉(zhuǎn)化或與中藥的某些生物活性成分發(fā)生反應(yīng)，以促進(jìn)藥物吸收［11］。而腸道菌群的改變對BA代謝至關(guān)重要。大黃煎劑被列入《慢加急性肝衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》1A級別證據(jù)，強烈推薦用于肝硬化并發(fā)HE［12］。大黃煎劑保留灌腸治療MHE可有效降低內(nèi)毒素及血氨水平，改善肝功能［13］。有研究指出在MHE患者血液中發(fā)現(xiàn)多種BA升高［14］，但是經(jīng)過大黃煎劑保留灌腸治療后的MHE患者血清中多種BA發(fā)生了變化［15］。然而，大黃煎劑調(diào)控血清中BA的機(jī)制尚未清楚，所以本研究旨在研究大黃煎劑保留灌腸對MHE大鼠BA代謝物的影響。利用代謝組學(xué)方法進(jìn)一步探索防止MHE進(jìn)展為HE的潛在治療機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)品和試劑 大黃（產(chǎn)地：甘肅，批號20211103）和烏梅（產(chǎn)地：福建，批號20210914）由廣西南寧萬寶堂藥業(yè)提供。CCl4（批號：1601168）購自合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)試劑廠；硫代乙酰胺（TAA）（批號：T70013）購自普西唐生物科技有限公司；甲酸（批號：94318）購自霍尼韋爾公司；甲醇（批號：A452-4）、異丙醇（批號：A461-4）購自費希爾化學(xué)公司；38種BA標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich（美國）和Steraloids公司（美國）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（批號：DH0006）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司）；NX10N快速血氨測定儀（日本Fujifilm公司）；7020型全自動生化分析儀（日本Hitach公司）；Agilent 2100生物分析儀（美國安捷倫科技公司）；5500 QTRAP質(zhì)譜儀（上海SCIEX分析儀器貿(mào)易有限公司）；Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)（美國Waters公司）；低溫高速離心機(jī)（德國eppendorf公司）；ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column色譜柱（美國Waters公司）；FE28型FiveEasy Plus臺式pH計（上海屹利科學(xué)儀器有限公司）

1.3 實驗動物 無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠55只，體質(zhì)量（180±20） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SYXK（湘）2019-0001，實驗動物使用許可證編號：SCXK（桂）2019-0004。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗室內(nèi)，室溫20～24 ℃，相對濕度控制在50%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)，空氣流通，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，期間自由飲食飲水。

1.4 分組及干預(yù) 55只大鼠運用簡單隨機(jī)分組法分為空白組（NC組）、HE組、MHE組和MHE大黃煎劑治療組（MHEY組）。各組大鼠進(jìn)行5 d的水迷宮尋臺訓(xùn)練，測試2次后，進(jìn)行HE及MHE模型大鼠制備。觀察各組大鼠體質(zhì)量、存活率、一般狀態(tài)，水迷宮檢測評估是否成模，成模后各組取10只大鼠。MHEY組給予大黃煎劑溶液連續(xù)灌腸14 d，其余各組予同體積蒸餾水灌腸。大黃煎劑的制備：將30 g大黃和30 g烏梅煎制成100 mL溶液，根據(jù)“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算200 g大鼠用量約為70 kg人的0.018，遂計算出每只大鼠的灌胃量為9 mL·kg-1·d-1。

1.5 HE及MHE模型制備 本實驗采用CCl4和乙醇構(gòu)建大鼠肝硬化模型［16］：將CCl4、橄欖油按2∶3比例混合配置成40% CCl4油溶液后于模型大鼠皮下注射，每周2次，持續(xù)9周。首周每次注射5 mL/kg，而后每次注射3 mL/kg，期間搭配5%乙醇溶液自飲，NC組普通飲水，每周腹下注射生理鹽水2次。之后采用TAA法構(gòu)建HE大鼠模型、MHE大鼠模型［17-18］，用生理鹽水配成40 mg/mL TAA溶液。HE組腹腔注射TAA（300 mg/kg），MHE、MHEY組腹腔注射TAA（200 mg/kg），NC組腹腔注射生理鹽水（5 mL/kg），每隔48 h腹腔注射，連續(xù)注射3次。TAA注射期間動物均飲用生理鹽水葡萄糖液（內(nèi)含100 g/L葡萄糖，0.9 g/L氯化鈉，20 mmol/L氯化鉀）。根據(jù)大鼠HE診斷標(biāo)準(zhǔn)，若大鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲緩，自主性活動減少、共濟(jì)失調(diào)、昏迷等癥狀之一，即可診斷HE［19］。若出現(xiàn)少許或未出現(xiàn)上述癥狀，但是血氨及肝功能均明顯高于正常組，病理組織學(xué)檢測提示肝衰竭，且水迷宮檢測顯示大鼠尋臺時間明顯延長，穿臺次數(shù)減少即可診斷MHE。

1.6 Morris水迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 將直徑為1.5 m的黑色圓形水池［水深30 cm，水溫（26±1） ℃］均等分為4個象限，在某一象限設(shè)置1個直徑10 cm的平臺隱匿于水下2 cm處，并在水中添加黑色顏料混勻，水池上方懸掛攝像機(jī)。定位巡航訓(xùn)練：共歷時5 d，每天定于固定時間段訓(xùn)練4次。訓(xùn)練開始時，從池壁四個起始點的任一點將大鼠面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺的時間和游泳路徑，4次訓(xùn)練將大鼠分別從4個象限放入水中。大鼠找到平臺后或60 s內(nèi)找不到平臺（潛伏期記為60 s），則由實驗者將其引導(dǎo)到平臺，在平臺上休息10 s，再進(jìn)行下一次試驗。每日以大鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為大鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績。空間探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后撤去平臺，在原平臺相對象限入水點將大鼠放入水中，記錄其120 s內(nèi)游泳路徑并統(tǒng)計穿越平臺次數(shù)。定位巡航實驗在造模后及給藥后各進(jìn)行1次，空間探索實驗在給藥后進(jìn)行1次。

1.7 樣品采集和制備 末次給藥后再次進(jìn)行Morris水迷宮實驗。之后按照體質(zhì)量比給予大鼠腹腔注射等比例的2%戊巴比妥鈉（0.03 mL/kg）深度麻醉，開腹在肝臟背面尋得膽管后置管引流膽汁至無菌EP管儲存在-80 ℃冰箱用于BA代謝組學(xué)分析，在腹主動脈采血行血氨及生化檢測；然后對各組大鼠實施安樂死，剪取肝左葉至無菌EP管儲存在-80 ℃冰箱用于Western Blot、PCR檢測，剪取肝右葉并取腦組織置于4%多聚甲醛中固定用于組織病理學(xué)分析，最后收集結(jié)腸和腸道內(nèi)容物至無菌EP管儲存在-80 ℃冰箱，用于隨后的pH檢測。

1.8 血氨、肝生化指標(biāo)及結(jié)腸內(nèi)容物pH測定 取血后應(yīng)用快速血氨測定儀檢測大鼠全血中氨的含量，應(yīng)用全自動生化儀檢測血清中AST、ALT、ALP、TBil及總膽汁酸（TBA）水平。取大鼠回盲腸后端結(jié)腸大約10 cm，采用pH計法檢測結(jié)腸內(nèi)容物pH值。

1.9 HE染色 取于4%多聚甲醛中固定24 h后的大鼠肝臟和腦，流水沖洗30 min，然后剪成組織大小約3 mm×2 mm×3 mm，各級酒精梯度脫水，二甲苯三級透明，浸蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片、黏片及烤片后HE染色并成像。

1.10 BA靶向代謝組學(xué) 首先每個膽汁樣本稀釋100倍，接著各取液體樣本100 μL，加入500 μL預(yù)冷甲醇及10 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋混合，-20 ℃孵育20 min沉淀蛋白；4 ℃條件下，14 000×g離心15 min，取上清真空干燥；質(zhì)譜檢測時加入甲醇-水（1∶1，50 μL/50 μL）復(fù)溶，4 ℃條件下，14 000×g離心15 min，取上清進(jìn)樣分析。

樣品采用Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動相：A相為0.1%甲醛水溶液，B相為甲醇。樣品置于8 ℃自動進(jìn)樣器中，柱溫45 ℃，流速為300 μL/min，進(jìn)樣量2 μL。相關(guān)液相梯度如下：0～6 min，B相從60%線性變化到65%；6～13 min，B相從65%線性變化至80%；13～13.5 min，B相從80%線性變化至90%；13.5～15 min，B相維持在90%。樣本隊列中每間隔一定數(shù)量的實驗樣本設(shè)置一個質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本，用于檢測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及重復(fù)性。

采用5500 QTRAP質(zhì)譜儀（AB SCIEX）在負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。5500 QTRAP ESI源條件如下：source temperature： 550 ℃； ion Source Gas1（Gas1）：55； Ion Source Gas2 （Gas2）： 55； Curtain gas （CUR）：40； ionSapary Voltage Floating（ISVF）： -4 500 V；采用MRM模式檢測待測離子對。采用Multiquant軟件提取色譜峰面積及保留時間。采用BA的標(biāo)準(zhǔn)品矯正保留時間，進(jìn)行代謝物鑒定。為進(jìn)一步定量篩選差異BA，應(yīng)用R軟件包“mixOmics”建立OPLS-DA模型以提取組間的差異信息。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃煎劑減弱CCl4及TAA誘導(dǎo)的MHE

2.1.1 對大鼠一般狀態(tài)的影響 HE組大鼠先后出現(xiàn)體質(zhì)量下降、嗜睡、反應(yīng)遲緩、各種反射逐漸消失、共濟(jì)失調(diào)、個別出現(xiàn)昏迷現(xiàn)象等。MHE組大鼠部分出現(xiàn)反應(yīng)遲緩和自主性活動減少，未出現(xiàn)嗜睡、共濟(jì)失調(diào)、昏迷等HE癥狀。MHEY組大鼠均未見上述癥狀。

2.1.2 對大鼠尋臺潛伏期與穿臺次數(shù)的影響 大黃煎劑干預(yù)后，定位航行訓(xùn)練及空間探索試驗檢測結(jié)果表明，與NC組比較，HE組、MHE組尋臺潛伏期（造模后、用藥后）顯著增加，穿臺次數(shù)顯著減少（P值均＜0.05）；與MHE組相比，MHEY組尋臺潛伏期（用藥后）顯著降低而穿臺次數(shù)顯著增加，HE組尋臺潛伏期顯著增加而穿臺次數(shù)顯著減少（P值均＜0.05）（表1）。

表1 水迷宮數(shù)據(jù)Table 1 Water maze data

2.1.3 對血氨、肝生化指標(biāo)及結(jié)腸內(nèi)容物pH值的影響 與NC組比較，HE組和MHE組AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及結(jié)腸pH值顯著增加（P值均＜0.05）；與MHE組相比，MHEY組AST、ALT、ALP、TBil、TBA及血氨及結(jié)腸pH值減少（P值均＜0.05），HE組AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及結(jié)腸pH值增加（P值均＜0.05）（表2）。

表2 四組間各指標(biāo)比較Table 2 Comparison of indicators among four groups

2.1.4 大鼠肝組織病理變化 光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝組織病理切片（圖1）。NC組肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰正常，未見肝細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤、細(xì)胞壞死等現(xiàn)象，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列。HE組假小葉形成，細(xì)胞紊亂，肝細(xì)胞水腫變性壞死明顯，重度炎癥細(xì)胞浸潤伴纖維組織增生，膽管數(shù)量明顯增多。MHE組中央靜脈周圍肝細(xì)胞排列紊亂，假小葉形成，肝細(xì)胞水腫變性減輕，輕度炎癥細(xì)胞浸潤，膽管數(shù)量較HE組減少。MHEY組中央靜脈周圍肝細(xì)胞較整齊，有假小葉形成；肝細(xì)胞水腫變性較MHE組明顯減輕，重度炎細(xì)胞浸潤，膽管數(shù)量較MHE組減少；整體損傷水平較MHE組減少。

圖1 肝組織HE染色（×200）Figure 1 Liver tissue HE staining image（×200）

2.1.5 大鼠腦組織病理變化 NC組腦組織結(jié)構(gòu)正常，排列整齊；HE組神經(jīng)元壞死嚴(yán)重、結(jié)構(gòu)不完整、排列紊亂、細(xì)胞核固縮、胞質(zhì)減少；與HE組相比，MHE組神經(jīng)元壞死較輕，MHEY組細(xì)胞壞死、排列紊亂、細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減輕，結(jié)構(gòu)逐漸完整（圖2）。

圖2 腦組織HE染色（×200）Figure 2 HE staining image of brain tissue （×200）

2.2 BA靶向代謝組學(xué)分析

2.2.1 靶向測序結(jié)果 對膽汁樣本的混樣QC樣本進(jìn)行BA靶向代謝組學(xué)的質(zhì)譜定性定量檢測分析，共測得BA代謝物23個。對數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行評價，待測物在QC樣本中的RSD結(jié)果顯示（圖3），代謝物RSD均小于30%，說明樣本中的分析數(shù)據(jù)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖3 QC RSD百分比圖Figure 3 Percentage chart of QC RSD

分別比較各組間大鼠膽汁中BA含量的差異（圖4），MHE組TBA、初級BA和次級BA均低于NC組（P值均＜0.05）；HE組TBA和初級BA低于MHE組（P值均＜0.05）；MHEY組TBA、初級BA高于MHE組（P值均＜0.05）。

圖4 BA統(tǒng)計分析圖Figure 4 Statistical analysis of bile acids

2.2.2 PCA分析 PCA顯示MHE成模前后大鼠膽汁的BA分別聚集成2個簇集，且經(jīng)過大黃煎劑治療前后的MHE大鼠膽汁的BA也分別聚集成2個簇集，提示健康大鼠發(fā)生MHE時，其膽汁中的BA發(fā)生了明顯變化，但經(jīng)過大黃煎劑治療后膽汁中的BA也發(fā)生了變化。而MHE和HE組大鼠的簇集重合率較高，說明這兩組的BA譜相似（圖5）。

圖5 PCA散點圖Figure 5 PCA scatter plot

2.2.3 OPLS-DA分析 Scores plot中橫坐標(biāo)表示OSC過程中主成分的得分，代表兩組樣本間的差異；縱坐標(biāo)表示OSC過程中正交成分的得分，代表各組內(nèi)樣本間的差異（圖6）。MHE組和NC組間分離趨勢明顯，代表兩組間代謝產(chǎn)物差異明顯；MHE組和MHEY組存在組間分離趨勢，代表兩組間代謝產(chǎn)物存在差異；而MHE組和HE組趨勢較近，代表兩組間代謝產(chǎn)物差異不明顯；但四組內(nèi)數(shù)據(jù)均不集中，代表組內(nèi)樣本代謝產(chǎn)物均存在一定的差異。

圖6 OSC散點圖Figure 6 OSC scores plot

對OPLS-DA模型進(jìn)行Permutation檢測，對數(shù)據(jù)進(jìn)行200次隨機(jī)排列組合實驗。MHE組與NC組對比模型、MHE組與MHEY組對比模型的Q2和R2均＞0.5，P值均＜0.05，說明具有較高的解釋力和預(yù)測能力，可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)分析；而MHE組與HE組對比模型的R2＜0.4，說明此模型不適用于下一步的數(shù)據(jù)分析。

成功建立OPLS-DA模型后，結(jié)合P-value和變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值篩選差異顯著的BA，VIP值＞1時，差異顯著，P＜0.05。MHE組與NC組對比，差異顯著的BA有12個，GCDCA、GUDCA、GHDCA、TCDCA、TUDCA、GLCA和TLCA減少，γ-MCA、THCA、7-KDCA、AlloLCA、α-MCA增加。MHEY組與MHE組對比，差異顯著的BA有5個，THDCA、TMCA、TCDCA、TUDCA和TLCA增加（附錄A和表3）。

3 討論

實驗數(shù)據(jù)顯示，結(jié)合大鼠一般狀態(tài)觀察及Morris水迷宮檢測，MHE組大鼠部分出現(xiàn)反應(yīng)遲緩和自主性活動減少，認(rèn)知功能下降，HE組大鼠先后出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲緩、共濟(jì)失調(diào)甚至昏迷，學(xué)習(xí)和記憶能力嚴(yán)重下降，MHEY組大鼠均未見上述癥狀。此外，血清中AST、ALT、ALP、TBil、TBA、血氨及結(jié)腸pH值生化指標(biāo)的變化表明，HE組比MHE組肝衰竭程度更嚴(yán)重，而大黃煎劑干預(yù)MHE大鼠后各項指標(biāo)均好轉(zhuǎn)。另外，結(jié)合肝組織和腦組織病理切片，說明大黃煎劑有較好的保護(hù)肝細(xì)胞、改善肝功能的作用，并可以降低大鼠結(jié)腸內(nèi)容物的pH值，降低血氨，恢復(fù)MHE大鼠認(rèn)知功能。

有研究［20-21］表明，腸道和大腦之間的雙向串?dāng)_對于維持宿主體內(nèi)平衡至關(guān)重要，并在神經(jīng)、激素和免疫學(xué)水平上受到調(diào)節(jié)，腸道菌群在腸-肝-腦相互作用中起著重要作用，BA對腸道菌群的擾動會影響腸-肝-腦軸以改變行為反應(yīng)［22］。結(jié)合和非結(jié)合BA先前已在非認(rèn)知受損的人類及嚙齒動物的大腦中被檢測到，并且相同的BA主要存在于循環(huán)中［23-24］。盡管在低活性的大鼠腦提取物中觀察到鵝去氧膽酸（CDCA）由24-羥基膽固醇合成［25］，但據(jù)推測，大部分腦BA是從外周循環(huán)運輸?shù)模?6］。BA是FXR、G蛋白偶聯(lián)受體5、肝X受體、孕烷X受體和維生素D受體等多種核受體的天然配體，在腦和外周器官均有表達(dá)［25，27］。腦中的BA在認(rèn)知功能、記憶和學(xué)習(xí)中的作用與這些核受體及幾種神經(jīng)遞質(zhì)受體的激活有關(guān)，包括M2和M3毒蕈堿乙酰膽堿受體、γ-氨基丁酸和N-甲基-D-天冬氨酸受體［28］。研究［29］表明，未結(jié)合BA和次級BA的缺失會導(dǎo)致回腸中FXR的激活，這可能會損害抗炎途徑和腸道屏障功能，最終誘導(dǎo)MHE的發(fā)生。此外，回腸中的FXR先前也被證明可以激活FGF15的表達(dá)，F(xiàn)GF15進(jìn)入肝腸循環(huán)，激活肝中的FXR調(diào)節(jié)肝臟SHP/LRH-1途徑，進(jìn)而下調(diào)CYP7A1的表達(dá)，減少BA合成，而合成BA的原料膽固醇肝內(nèi)蓄積也可進(jìn)一步加重肝損傷［30］。而且，BA濃度的降低可升高腸道pH值和無法控制具有脲酶的菌種生長引起血氨升高［31］。有研究［32］顯示，喂食富含BA抑制劑消膽胺飼料的小鼠血清和腦BA含量降低，從而減輕了與MHE相關(guān)的神經(jīng)功能損害。在急性肝衰竭大鼠中，F(xiàn)XR及其輔助因子小異二聚體伴侶在額葉皮層中的表達(dá)增加。直接向額葉皮質(zhì)注入FXR特異性抑制劑對急性HE相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥具有保護(hù)作用［33］。

本研究結(jié)果顯示大鼠發(fā)生MHE時，肝FXR表達(dá)增加，初級BA濃度降低，大黃煎劑干預(yù)后可能通過調(diào)節(jié)菌群，影響腸內(nèi)BA池，通過抑制回腸FXR-FGFR4使肝FXR表達(dá)降低，BA濃度回調(diào)。MHE大鼠GCDCA、GUDCA、GHDCA、TCDCA、TUDCA、GLCA和TLCA減少，γ-MCA、THCA、7-KDCA、AlloLCA、α-MCA增加，大黃煎劑干預(yù)后，THDCA、TMCA、TCDCA、TUDCA和TLCA回調(diào)；MHE組與HE組組成相似。據(jù)報道［34］，TUDCA在防止肝細(xì)胞凋亡和保護(hù)線粒體免受干擾能量產(chǎn)生的不利細(xì)胞因素的影響方面發(fā)揮作用。BA進(jìn)入大腦的機(jī)制以及它們?nèi)绾未嬖谟谀X脊液中是未知的。最近的研究［35］顯示，腦中疏水性BA通過涉及緊密連接蛋白閉塞的Rac1-dependent磷酸化的機(jī)制增加了血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的通透性，而非結(jié)合BA疏水性強于結(jié)合BA。隨著BBB通透性增加，血清中非結(jié)合BA被動擴(kuò)散到大腦中加重MHE［33］。有研究［35］顯示，腸道微生物組調(diào)節(jié)失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞毒性次級BA如脫氧膽酸及其衍生物的產(chǎn)生增加，這些細(xì)胞毒性次級BA可以調(diào)節(jié)BBB并在大腦中積累，從而導(dǎo)致其受體和靶標(biāo)介導(dǎo)的代謝功能受損引起認(rèn)知功能障。雖然本研究不是檢測血清中BA代謝譜，但是檢測膽汁中BA能更直觀地反應(yīng)腸道菌群與BA代謝的關(guān)系。當(dāng)大鼠發(fā)生MHE時，膽汁中非結(jié)合BA是升高的。課題組推測膽汁中BA的變化引起了血清中非結(jié)合BA的升高，進(jìn)而增加BBB的通透性誘發(fā)MHE。而且可以推測當(dāng)MHE發(fā)生時，肝內(nèi)如TUGDA一類保護(hù)肝細(xì)胞的BA濃度下降，毒性BA升高，進(jìn)一步加重肝損傷。大黃煎劑可以逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。而且HE組和MHE組的BA組成相似，說明HE是MHE進(jìn)展而來，發(fā)病機(jī)制類似。

BA與腸道菌群兩者本身就是相互調(diào)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)了BA腸肝循環(huán)在MHE發(fā)病中的重要性，加強肝病與腸-肝-腦軸之間的關(guān)系，并且進(jìn)一步探討了大黃煎劑保留灌腸治療MHE的機(jī)制。雖然本實驗未直接證實膽汁中Ras的變化可導(dǎo)致MHE，但是可以推測得出與MHE發(fā)病密切相關(guān)，并且其與腸道菌群密切相關(guān)，相互調(diào)控，為接下來深層次的研究奠定了基礎(chǔ)。由于資金和時間限制，本研究存在以下缺點：未研究腦、血液和腸道中的BA代謝譜。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年8月28日經(jīng)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批，批號：DW20220826-162，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。所有實驗操作嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王萌、毛德文負(fù)責(zé)課題設(shè)計；杜沅沁負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文并最后定稿；鐘瑞熙、徐健、黃國初、黃良江負(fù)責(zé)實驗實施，分析數(shù)據(jù)；黃晶晶、譚欽文負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)整理；姚春負(fù)責(zé)實驗指導(dǎo)。