葉曉莉 王叢瑤 何佳 莊建建 朱學(xué)敏 王彬輝 林能明

腫瘤心臟病學(xué)主要研究抗腫瘤藥物的心臟毒性、合并的心血管疾病與腫瘤共有的危險因素及心臟腫瘤等[1-2]。臨床上使用藥物治療腫瘤經(jīng)常導(dǎo)致心臟損傷[3]。在增強藥物抗腫瘤作用的同時減輕心臟毒性成為目前腫瘤心臟病學(xué)臨床亟需解決的關(guān)鍵問題。鹽酸阿霉素（adriamycin，ADM）屬蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，是治療乳腺癌的一線抗腫瘤藥物[4]。然而，ADM 穩(wěn)定性差，血漿半衰期極短，長期服用會導(dǎo)致劑量依賴性的心臟毒性，臨床應(yīng)用受限[5-7]。他汀類藥物具有內(nèi)在抗氧化特性和抗細胞凋亡作用，可抑制腫瘤細胞增殖[8-9]，降低心臟猝死發(fā)生率，可作為蒽環(huán)類藥物的心臟毒性保護劑[10]。辛伐他?。╯imvastatin，SIM）已應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療[11]，與ADM 聯(lián)用可增強抗乳腺癌作用，改善腫瘤藥物靶向性，減輕全身毒性反應(yīng)。納米粒（nanoparticles，NPs）是指由天然或合成高分子材料制成的粒徑為10～1 000 nm 的固態(tài)膠體微粒[12]。NPs包載可提高藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長藥物駐留時間，具有靶向釋藥、增強療效、提高生物利用度等優(yōu)點[13-15]。本研究以聚乙二醇-聚乳酸（polyethyleneglycol polylacticacid，PEG-PLA）為載體構(gòu)建靶向遞藥系統(tǒng)ADM/SIM 雙載藥納米粒（adriamycin/simvastatin coloaded nanoparticles，ADM/SIM-NPs），探索治療乳腺癌的新方法，以期為研制治療惡性腫瘤的雙載藥納米粒制劑提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 ADM 原料藥、ADM 對照品購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號分別為K2013176、H2119032，純度均≥98%；SIM 原料藥、SIM對照品購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號分別為K2017172、K2017172，純度均≥97%；PEG2000-PLA 購于山東濟南岱罡生物工程有限公司，批號：2021050911；聚乙烯醇（PVA）購于江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司，批號：20160301。

1.2 方法

1.2.1 ADM 和SIM 色譜條件 ADM 色譜柱為Diamonsil C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶0.2%磷酸水溶液=28∶72；柱溫30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量為20 μL。SIM色譜柱為Diamonsil C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈∶0.2%磷酸水溶液=80∶20；柱溫30 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長為238 nm；進樣量為20 μL。

1.2.2 ADM/SIM-NPs 的制備及工藝優(yōu)化 取適量ADM 溶于雙蒸水作為內(nèi)水相；取一定量PEG2000-PLA和SIM 溶于甲醇溶劑作為有機相，調(diào)整ADM 和SIM 的質(zhì)量比為2∶1?；旌蟽?nèi)水相與有機相，冰浴超聲得到初乳；另取PVA 水溶液作為外水相；并與初乳混合，冰浴超聲得到復(fù)乳；繼續(xù)攪拌，室溫減壓蒸發(fā)掉有機溶劑和部分水，即得到ADM/SIM-NPs。不加藥物即為空白NPs。選擇總藥物與PEG2000-PLA 質(zhì)量比（A）、內(nèi)水相與有機相體積比（B）、有機相與外水相體積比（C）、外水相PVA 質(zhì)量濃度（D）為考察因素，通過L9（34）正交試驗優(yōu)化處方測定包封率和載藥量。包封率和載藥量各占50%的系數(shù)積分，綜合評分=總藥物包封率×50%+總藥物載藥量×50%。綜合評分越高，說明制備工藝越佳。

1.2.3 色譜方法建立 分別精密移取ADM 和SIM 標(biāo)準品貯備液，制備系列標(biāo)準溶液，濃度分別為0.780、1.560、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000 mg/L，線性回歸后繪制標(biāo)準曲線。分別配制低（6.250 mg/L）、中（12.500 mg/L）、高（25.000 mg/L）3 個濃度的ADM 或SIM 標(biāo)準品溶液，按1.2.1 項條件測定日內(nèi)、日間精密度。制備10.000、12.500、15.000 mg/L 的ADM 或SIM納米粒溶液，測定回收率。分別取適量ADM 和SIM標(biāo)準品貯備液，重復(fù)6 次，高效液相色譜測定藥物濃度。分別取ADM 或SIM 同一樣品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 進樣，測定溶液穩(wěn)定性。分別取ADM 和SIM 標(biāo)準品溶液、空白NPs 混懸液和ADM/SIM-NPs 進樣分析，得到色譜圖。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 ADM/SIM-NPs 形態(tài)學(xué) 取ADM/SIM-NPs 混懸液滴于銅網(wǎng)，采用磷鎢酸負染法制備，透射電鏡觀察。

1.3.2 ADM/SIM-NPs 粒徑 取ADM/SIM-NPs 混懸液用少量純水稀釋后，釆用馬爾文激光粒度測定儀測定并采集粒徑分布。

1.3.3 藥物的包封率與載藥量 ADM 的包封率和載藥量通過超濾離心法測定。采用截留相對分子質(zhì)量為30 kDa 超濾離心管，移取1.0 mL ADM/SIM-NPs 置上端，5 000 r/min 離心20 min，收集濾液，加入甲醇定容，0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，采用高效液相測定ADM 質(zhì)量（W游離）。另取1.0 mL ADM/SIM-NPs 加甲醇超聲定容破乳，高效液相測定ADM 總質(zhì)量（W總）。包封率（%）=（1-W游離/W總）×100%；載藥量（%）=（W總-W游離）/Wt。其中W游離為ADM/SIM-NPs 中未被包封的ADM 質(zhì)量；W總為ADM/SIM-NPs 中ADM 質(zhì)量；Wt為ADM/SIM-NPs 的總質(zhì)量。

SIM 的包封率和載藥量通過低速離心法測定。移取1.0 mL ADM/SIM-NPs 加入1.5 mL 離心管，8 000 r/min 離心5 min，取上清液加甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，釆用高效液相測定SIM 質(zhì)量（W包封）；另取1.0 mL ADM/SIM-NPs，加甲醇定容破乳，高效液相測定SIM 總質(zhì)量（W總）。包封率（%）=（W包封/W總）×100%；載藥量（%）=W包封/Wt。其中W包封為ADM/SIM-NPs 中包封的SIM 質(zhì)量；W總為ADM/SIMNPs 中SIM 的質(zhì)量；Wt為ADM/SIM-NPs 的總質(zhì)量。

1.4 體外釋放度測定 以含有2%吐溫-80 的PBS（pH=7.4）為釋放介質(zhì)，移取ADM 溶液、SIM 溶液、ADM/SIM-NPs 各3 份，1 mL/份，分別轉(zhuǎn)移到經(jīng)預(yù)處理的透析袋內(nèi)，確保透析袋全部浸沒在介質(zhì)中。開啟恒溫振蕩儀，（37.0±0.5）℃，100 r/min 分別于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 取樣，補加等量同溫釋放介質(zhì)，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液測定ADM 和SIM 質(zhì)量，計算累積釋放百分率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 設(shè)計L9（34）正交試驗。精密度、回收率、重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測的相對偏差＜5%，認為符合方法學(xué)要求。分別用零級、一級動力學(xué)模型、Higuchi 模型、Rigter-Peppas 模型對ADM/SIM-NPs 體外釋藥行為進行擬合。

2 結(jié)果

2.1 ADM 和SIM 方法學(xué)觀測

2.1.1 ADM 和SIM 的專屬性 高效液相色譜圖結(jié)果顯示ADM 和SIM 藥物峰峰形良好，色譜峰專一，ADM和SIM 的保留時間分別為5.47 和8.94 min，見圖1-2。

圖1 ADM 高效液相色譜圖（A：ADM 對照品溶液；B：空白NPs；C：ADM/SIM-NPs 混懸液）

圖2 SIM 高效液相色譜圖（A：SIM 對照品溶液；B：空白NPs；C：ADM/SIM-NPs 混懸液）

2.1.2 ADM 和SIM 的標(biāo)準曲線 ADM 標(biāo)準曲線方程：y=55 763x+16 103，R2=0.999 9（n=3），表明ADM 在0.78～100.00 mg/L 與峰面積線性關(guān)系良好。SIM 標(biāo)準曲線方程：y=68 759x+33 931，R2=0.999 7（n=3），表明SIM 在0.78～100.00 mg/L 與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 ADM 和SIM 的精密度和回收率 精密度試驗結(jié)果見表1，回收率試驗結(jié)果見表2，相對偏差均＜5%，符合方法學(xué)要求。

表1 ADM和SIM的精密度檢測（n=6）

表2 ADM和SIM的回收率檢測（n=6）

2.1.4 ADM 和SIM 的重復(fù)性和穩(wěn)定性 ADM 和SIM的重復(fù)性檢測相對偏差分別為0.56%和0.40%（n=6），均＜5%，符合方法學(xué)要求。穩(wěn)定性檢測的相對偏差分別為1.07%和1.15%，均＜5%，符合方法學(xué)要求，表明樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 ADM/SIM-NPs 制備的優(yōu)化工藝 選擇藥物與PEG2000-PLA 質(zhì)量比（A）、內(nèi)水相與有機相體積比（B）、有機相與外水相體積比（C）、外水相PVA 質(zhì)量濃度（D）為考察因素，每個因素各取3 個水平，進行正交設(shè)計。A 因素選擇1∶10、1∶15 和1∶20 3 個水平；B 因素選擇1∶2、1∶5 和1∶10 3 個水平；C 因素選擇1∶2、1∶5 和1∶10 3 個水平；D 因素選擇1%、2%和3% 3 個水平。綜合加權(quán)評分法對正交結(jié)果進行綜合分析，結(jié)果顯示，各因素對包封率和載藥量的影響程度依次為：藥物與PEG2000-PLA 質(zhì)量比（A）＞外水相PVA 質(zhì)量濃度（D）＞內(nèi)水相與有機相體積比（B）＞有機相與外水相體積比（C）。即藥物與PEG2000-PLA 質(zhì)量比是影響ADM/SIM-NPs 包封率的第一因素（P＜0.05），內(nèi)水相與有機相比例、有機相與外水相體積比、外水相PVA 濃度影響較小（P＞0.05）。經(jīng)過運算可得出每個因素各水平之和的平均值K1、K2、K3，綜合各因素K值和直觀比較，最佳處方為A3B3C1D2，見表3。

表3 正交試驗設(shè)計和結(jié)果

2.3 最佳工藝驗證 按最佳工藝制備ADM/SIM-NPs，粒徑和Zeta 電位分別為（84.46±3.62）nm、（-3.13±0.11）mV；ADM 包封率和載藥量分別為（95.57±0.82）%、（2.03±0.14）%，SIM 包封率和載藥量分別為（90.81±0.02）%、（1.32±0.01）%。制成的ADM/SIMNPs 呈圓球形，粒徑大小分布均勻，無團聚，工藝效果較好。

2.4 游離ADM、游離SIM 和ADM/SIM-NPs 體外釋放檢測 體外釋放實驗表明游離ADM 和SIM 溶液在2%吐溫-80 的PBS 中釋放較快，4 h 累積釋放百分率分別達60%和80%，12 h 基本透出完全。ADM/SIM-NPs 釋藥較為緩慢，24 h ADM 和SIM 累積釋放百分率約為50%和40%。ADM/SIM-NPs 的釋藥過程可分為2 個階段：0～4 h 時快速釋藥，5～24 h 時釋藥漸平穩(wěn)，見圖3。以Q為釋放量，t為時間，分別用零級、一級動力學(xué)模型、Higuchi 模型、Rigter-Peppas 模型對ADM/SIM-NPs體外釋藥行為進行擬合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADM 從ADM/SIM-NPs 中釋出擬合的零級動力學(xué)模型方程為Q=0.016 6t+0.179 3，R2=0.904 7；一級動力學(xué)模型方程為ln（1-Q）=-0.026 0t-0.185 8，R2=0.955 9；Higuchi 模型方程為Q=0.097 7t+0.069 3，R2=0.991 6；Rigter-Peppas 模型方程為lnQ=0.379 6t-1.827 3，R2=0.994 5。SIM 從ADM/SIM-NPs釋出的零級動力學(xué)模型方程為Q=0.009 1t+0.198 8，R2=0.785 9；一級動力學(xué)模型方程為ln（1-Q）=-0.012 7t-0.220 9，R2=0.820 6；Higuchi 模型方程為Q=0.097 7t+0.069 3，R2=0.940 2；Rigter-Peppas 模型方程為lnQ=0.252 7t-1.720 1，R2=0.984 5。Rigter-Peppas方程R2值最接近1，擬合度較高；故ADM/SIM-NPs 釋放特性符合該方程。

圖3 游離ADM、游離SIM 和ADM/SIM-NPs 的體外釋放曲線（n=3）

3 討論

乳腺癌發(fā)病率約占全球女性癌癥的30%[16]，嚴重威脅人類健康。ADM 是臨床治療乳腺癌的一線用藥，但由于具有心臟毒性而被限制使用[17-19]。ADM 心臟毒性是多種因素共同作用的結(jié)果，原因是ADM 在體內(nèi)可產(chǎn)生大量活性氧自由基，引發(fā)脂質(zhì)過氧化，造成心肌細胞損傷[20]。目前臨床應(yīng)用較廣泛的抗阿霉素心臟毒性藥物有右丙亞胺、左卡尼汀等，但右丙亞胺會加重抗腫瘤藥物對患者骨髓的抑制作用，左卡尼汀對阿霉素所致的心臟損傷僅有預(yù)防而無治療作用。因此，如何在降低ADM 毒性反應(yīng)的同時不影響甚至增強ADM的治療效果成為研究熱點。膽固醇是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病的重要風(fēng)險因子，他汀類藥物可通過阻斷膽固醇合成起到抑制腫瘤細胞生長的作用[21-22]。SIM 在調(diào)節(jié)血脂的同時還具有抗炎、抗氧化、抑制心肌肥厚、抗心肌纖維化和細胞凋亡等多重作用[23]，對蒽環(huán)類藥物具有心臟保護作用。一項回顧性臨床隊列研究發(fā)現(xiàn)，化療前和化療同時不間斷他汀類藥物治療能顯著降低乳腺癌患者心力衰竭風(fēng)險[24]。本研究制備的ADM/SIM-NPs 在降低ADM 毒副反應(yīng)的同時增強ADM 的治療效果，達到藥物在靶器官濃集、緩釋及增效減毒等目的。

本實驗通過復(fù)乳溶液揮發(fā)法成功制備雙載藥納米粒，方法簡單，制得的雙載藥納米粒粒徑小且分布均勻、包封率較高。一方面可以發(fā)揮SIM 心臟保護作用，減少ADM 在化療期間造成的心臟損傷，減輕藥物毒副反應(yīng)。另一方面ADM 和SIM 被動靶向遞送于腫瘤組織，增強了ADM 在增殖腫瘤細胞中的攝取量，提高了藥物的生物利用率。由于ADM/SIM-NPs 粒徑僅（84.46±3.62）nm（＜200 nm），可經(jīng)腫瘤高通透滯留效應(yīng)被動靶向于腫瘤所在部位，有效提高了藥物在病灶處的濃度。以PEG-PLA 作為載體的NPs 具有血液長循環(huán)特性，可有效保護藥物免受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，從而減少給藥次數(shù)和藥量[25]。本研究發(fā)現(xiàn)在固定有機相的前提下，增加內(nèi)水相可使藥物在擴散到外水相的過程中油層變薄，更有利于藥物擴散。因此，過大的內(nèi)水相可導(dǎo)致藥物有更多機會擴散出內(nèi)乳劑，減少藥物的包封率。

透析袋擴散法考察ADM/SIM-NPs 的釋放特性發(fā)現(xiàn)，其釋放特性符合Ritger-Peppas 方程且具有緩釋的效果。由于SIM 屬于脂溶性藥物，難溶于水，在釋放介質(zhì)為pH 7.4 的PBS 中的累積釋放百分率＜20%，故選擇含2%吐溫-80 的PBS（pH=7.4）為溶出介質(zhì)以增加溶解度。體外釋放實驗表明游離ADM 和SIM 溶液在該介質(zhì)中釋放較為平穩(wěn)，處于緩慢釋放狀態(tài)，24 h累積釋藥量分別約為50%和40%，可能是由于藥物主要通過載體表面膜的孔隙擴散及載體骨架的溶蝕。NPs 突釋現(xiàn)象不明顯，后期釋放具有緩釋特征，且ADM 釋放速度和累積釋放百分率均高于SIM，分析原因可能是ADM 的水溶性比SIM 好，在親水性釋放介質(zhì)中更容易擴散，而SIM 由于疏水性較強，不易向外水相擴散。

綜上所述，本研究采用復(fù)乳溶液揮發(fā)法成功制備了ADM/SIM-NPs，確定了最優(yōu)制備處方工藝，制備的雙載藥納米粒粒徑分布均一、穩(wěn)定性好、具有緩釋效果。