尹志鵬，張 全，譚 俊，雷明盛

（湖南省張家界市人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖南 張家界 427000）

哮喘是一種患病人數較多的呼吸系統疾病，其典型特征是患者氣道存在慢性炎癥及高反應性[1]。西醫(yī)對其的治療主要是給予糖皮質激素進行抗炎、β2 受體激動劑舒張支氣管等[2]。大承氣湯最早記載于《傷寒論》中，為“肺腸同治”典型藥方，有通腑泄熱、峻下熱結等效，以往常用于治療胰腺炎、腸梗阻等病癥[3]。有研究報道，大承氣湯能夠改善呼吸窘迫綜合征等肺系疾病患者肺部損傷，并減輕其炎癥反應，改善患者免疫功能[4-5]。目前關于大承氣湯用于過敏性哮喘的研究較少，其治療過敏性哮喘的作用機制也缺乏理論依據支持。有研究報道，輔助性T 細胞（Th）1/Th2 比例失衡在哮喘發(fā)作中有重要地位；同時，有研究顯示，p38 蛋白激酶（p38 MAPK）通過調控白細胞介素（IL）-4 等細胞因子參與到炎癥反應中，由此推測大承氣湯治療過敏性哮喘、減輕炎癥反應可能與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）與Th1/Th2 平衡有關[6-7]。本次研究對過敏性哮喘小鼠應用大承氣湯，觀察大承氣湯對MAPK 信號通路和Th1/Th2 的影響，以探討大承氣湯治療過敏性哮喘的機制，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c 小鼠40 只，6 ～8 周齡，體質量20 ～25 g，恒溫恒濕，自由食水。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 美國Sigma 公司生產，卵清白蛋白（OVA），四甲基乙二胺（TEMED），十二烷基硫酸鈉（SDS）十二烷基硫酸，批號依次是SLBM7240V，T9281，L3771；地塞米松片（福州海王福藥制藥有限公司，國藥準字H35021170）；美國Thermo 公司生產，BCA 蛋白測定試劑盒，廣譜彩虹預染低蛋白Marker，氫氧化鋁凝膠，批號依次是A53225，26628，R1235952B；美國CST 公司生產，磷酸化（p）-MAPK 單克隆抗體，MAPK 單克隆抗體，批號依次是9910，9926；美國Abgent 公司生產，羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G-辣根過氧化物酶（HRP）二抗，β-肌動蛋白（β-actin）抗體，批號分別為ASS1007，AM1021B；Bio legend 公司生產，IL-4 ELISA Kit、IL-17A ELISA Kit、INF-γ ELISA Kit，批號分別為B187236、B181929、B1887025；深圳達科生物技術公司生產，mIL-5 檢測試劑盒；迪夫快速染液，批號為L9210789。顯微鏡（美國Olympus 公司，型號TH4-200），石蠟切片機（德國Microm 公司，型號HM325），1703930 型濕轉電轉印儀、數碼凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司），高速離心機（德國Eppendorf公司，型號5415），酶標儀（瑞士Tecan公司）。1.1.3 大承氣湯的制備 大承氣湯藥方組成：大黃、枳實各12 g，厚樸24 g，芒硝9 g，藥物浸泡30 min 后，武火煎煮10 min，再以文火煎煮20 min，煎煮2 次，將所得藥液混合，水煎濃縮含生藥1.9 g/mL，通過雙層紗布濾過藥液，分裝儲存于4℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的構建與給藥 小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，通過隨機數字表法將小鼠分為空白對照組（A組）、模型組（B 組）、地塞米松組（C 組）和大承氣湯組（D 組），每組各10 只。通過OVA 致敏激發(fā)構建過敏性哮喘小鼠模型，分別在第0 天、第14 天，B 組、C 組和D 組每只小鼠于腹腔注射0.2 mL 抗原液（氫氧化鋁2 mg，OVA 20 μg），A 組給予等量生理鹽水注射；第21 ～27 天，將小鼠放進霧化箱中，B 組、C 組和D 組霧化吸入1% OVA 激發(fā)，A 組小鼠給予生理鹽水霧化，每日1 次，每次0.5 h；C 組及D 組在霧化前1 h 分別給予地塞米松及大承氣湯干預，每只0.2 mL，A 組、B 組給予等量生理鹽水。地塞米松給藥量：0.005 g/kg，大承氣湯給藥量：19 g/mL。

1.2.2 肺指數測定 實驗結束后，測量小鼠體質量。小鼠麻醉后處死，打開胸腔，取出肺組織，通過生理鹽水沖凈后吸除其表面液體，測量肺組織質量，肺指數＝小鼠肺質量（g）/小鼠體質量（g）×100 %。

1.2.3 氣管肺泡灌洗液（BALF）的獲取及細胞計數 氣管插管插入氣管內1 cm 進行縫合固定，用0.8 mL 含0.5 %牛血清白蛋白（BSA）的無菌PBS 緩沖液灌洗氣管、支氣管及全肺并回收，進行離心處理后使用1 mL 含0.5 % BSA 的PBS 緩沖液重懸細胞計算細胞總數，通過迪夫染液迅速染色，拍照，細胞分類計數，取300 個細胞計算其中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的比例，依據細胞總數計算BALF 中各類炎癥細胞數量。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測MAPK 信號通路蛋白表達 造模完畢后，取100 mg 肺組織，放在冰上的1.5 mL離心管中，然后放進-80℃冰箱中儲存。使用RIPA 裂解液提取總蛋白后對蛋白濃度進行檢測，利用聚丙烯酰胺電泳依據相對分子質量大小進行分離，利用濕轉法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），加入封閉液后置于搖床上于室溫下封閉孵育2 h，將一抗p38 蛋白激酶（p38 MAPK），細胞外調節(jié)蛋白激酶（ERK），p-p38 MAPK 及p-ERK1/2 按1:1 000 稀釋后分別加入適量，搖床上4℃孵育過夜；使用聚山梨酯與三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBST）緩慢沖洗3 次，分別加入相應1:5 000 稀釋后二抗，于室溫下孵育2 h，TBST 緩慢沖洗3 次，通過化學發(fā)光試劑，暗室內曝光顯影，進行圖像分析，檢測目的蛋白及內參β-actin 灰度值。

1.2.5 BALF 中細胞因子檢測 取離心后染色清液，通過對應試劑盒對人干擾素-γ（INF-γ）、IL-4、IL-5、IL-17A 水平進行檢測。

1.2 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間行方差齊性檢驗；計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠肺指數水平比較 A組肺指數為（0.639±0.003），B 組肺指數為（0.725±0.005），C 組肺指數為（0.680±0.006），D 組肺指數為（0.673±0.005），肺指數水平：A 組＜D 組＜C 組＜B 組（P＜0.05）。

2.2 4 組小鼠BALF 中細胞總數及各類炎癥細胞數目比較 總細胞數水平：A 組＜C 組＜D 組＜B 組（P＜0.05）；嗜酸性粒細胞水平：A 組＜C 組＜D 組＜B 組（P＜0.05）；中性粒細胞水平：A組＜C組＜D組＜B組（P＜0.05）；淋巴細胞水平：A 組＜C 組＜D 組＜B組（P＜0.05）；巨噬細胞水平：A 組＞B 組＞D 組＞C 組（P＜0.05）。見表1。

表1 4 組小鼠BALF 中各類炎癥細胞數目比較（±s，n = 10） ×105/mL

表1 4 組小鼠BALF 中各類炎癥細胞數目比較（±s，n = 10） ×105/mL

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05

組別總細胞數嗜酸性粒細胞數中性粒細胞數淋巴細胞數巨噬細胞數A 組 3.76±0.24 0.29±0.130.28±0.090.39±0.102.80±0.19 B 組29.08±4.68#14.35±4.92#7.27±1.41#6.28±1.29#0.69±0.05#C 組 9.95±3.21#△ 3.37±0.91#△2.17±0.70#△2.09±0.31#△0.20±0.05#△D 組18.14±2.51#△▲ 7.57±0.59#△▲4.68±0.79#△▲3.18±0.24#△▲0.29±0.03#△▲F 值124.37458.313118.756134.4431422.540 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 4 組小鼠肺組織MAPK 信號蛋白表達水平比較 以β-actin 為內參對照，p-p38/β-actin 水平：A 組＝C組＜B組（P＜0.05），C組＝D組＜B組（P＜0.05），A 組＜D 組（P＜0.05）；p38/β-actin 水平：A 組＝C組＝D 組＝B 組（P＞0.05）；p-ERK1/2/β-actin 水平：A 組＜C 組＜D 組＜B 組（P＜0.05）；ERK1/2/β-actin水平：A 組＝C 組＝D 組＝B 組（P＞0.05）。見表2。

表2 4 組小鼠肺組織MAPK 信號蛋白表達水平比較（±s，n = 10）

表2 4 組小鼠肺組織MAPK 信號蛋白表達水平比較（±s，n = 10）

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05

組別p-p38/β-actinp38/β-actinp-ERK1/2/β-actinERK1/2/β-actin A 組0.60±0.070.68±0.110.19±0.051.19±0.14 B 組1.14±0.13#0.67±0.101.20±0.14#1.14±0.20 C 組0.64±0.08△0.68±0.090.69±0.08#△1.20±0.18 D 組0.72±0.10#△0.68±0.100.88±0.10#△▲1.18±0.13 F 值64.6070.025185.6970.254 P 值 0.0000.995 0.0000.858

2.4 4組小鼠BALF中細胞因子水平比較 INF-γ水平：A 組＞C 組＞D 組＞B 組（P＜0.05）；IL-4 水平：A 組＜C 組＜D 組＜B 組（P＜0.05）；IL-5 水平：A組＜C組＜B組（P＜0.05），A組＜D組（P＜0.05），C 組＝D 組（P＞0.05），B 組＝D 組（P＞0.05）；IL-17A 水平：A 組＜C 組＜D 組＜B 組（P＜0.05）。見表3。

表3 4 組小鼠BALF 中細胞因子水平比較（±s，n = 10） pg·mL-1

表3 4 組小鼠BALF 中細胞因子水平比較（±s，n = 10） pg·mL-1

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05；與C 組比較，▲P ＜0.05

組別IFN-γIL-4IL-5IL-17A A 組141.27±19.85 13.08±4.12 20.13±2.65 51.09±9.88 B 組 30.14±8.53#106.83±10.49#119.64±7.58#163.27±23.42#C 組 62.59±7.64#△ 56.38±7.91#△112.34±7.16#△ 81.95±15.53#△D 組 51.37±13.86#△▲ 71.84±20.65#△▲114.86±9.51#102.62±18.71#△▲F 值131.29798.079443.95872.495 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

過敏性哮喘是哮喘中最常見的類型，遺傳因素、過敏原接觸等均會使其發(fā)生風險上升。西醫(yī)理論認為其發(fā)病受遺傳與環(huán)境的雙重影響，患者在接觸變應原后，體內特異性免疫球蛋白E 與肥大細胞、嗜酸性粒細胞等細胞結合，使得炎癥介質分泌水平上升，進而發(fā)生哮喘[8-9]。中醫(yī)理論中將此病歸入“哮病”等范疇，認為其多因外感風邪、情志失暢等引起宿痰內伏于肺，以致痰阻氣道，肺失肅降，肺氣上逆，因此對其的治療以治肺為主[10]。中醫(yī)認為肺與大腸在經絡上相互絡屬，功能上相互協調，因此又有“肺與大腸相表里”之論，對于肺系、腸系疾病也采用“肺腸同治”之法[11]。

本次研究結果顯示，肺指數水平：A 組＜D 組＜C組＜B 組；p-p38/β-actin 及p-ERK1/2/β-actin 水平均C組、D 組明顯低于B 組；INF-γ 水平：A 組＞C 組＞D組＞B 組；IL-4、IL-17A 水平均A 組＜C 組＜D 組＜B組，提示大承氣湯具有與地塞米松相似的效果，能夠抑制MAPK 信號通路相關磷酸化蛋白表達，減少炎癥因子水平，調節(jié)Th1/Th2 平衡。MAPK 在信號從細胞表面?zhèn)髦良毎藘炔康倪^程中具有重要作用，其參與到細胞的增殖、分化、炎癥反應等多種重要過程中，包括ERK、p38 等4 個亞族[12]。MAPK 在堿形式中沒有活性，只有經過磷酸化后其活性才會被激發(fā)。輔助性T 細胞在免疫系統中占有核心地位，包括Th1 及Th2 2 個亞群，Th1 介導細胞免疫，主要調節(jié)IFN-γ、IL-2 等水平，Th2 介導體液免疫，主要調節(jié)IL-4、IL-5等炎癥因子水平[13]。一般情況下，Th1/Th2 系統處于平衡狀態(tài)，當機體受到外界刺激，Th1/Th2 即會失衡，造成炎癥反應[14]。大承氣湯中含有大黃、枳實、厚樸、芒硝4 味中藥，其中大黃具有清熱瀉火、瀉下攻積、祛痰等功效，對于宣降肺氣有所裨益；枳實能夠破氣消積、止咳化痰、止瀉通便，厚樸能夠燥濕消痰、下氣平喘、行氣消積，二者合用能夠行氣散結、平喘消痰；芒硝能夠瀉下通便、清火消腫，裨益大腸功能，通肺氣[15-17]?，F代藥理學研究發(fā)現，大黃中含有β-谷甾醇、蘆薈大黃素等有效成分，通過作用于鈣離子、P13K、MAPK 等信號通路，能夠發(fā)揮抗炎作用[18]。枳實中含有木犀草素、柚皮素等活性成分，能夠作用于腫瘤壞死因子、T 細胞受體等信號通路，來發(fā)揮抗炎作用[19]。

綜上所述，大承氣湯能夠改善過敏性哮喘小鼠肺損傷，其可能機制是抑制MAPK 信號通路磷酸化進程，調節(jié)Th1/Th2 平衡，進而減輕炎癥。