管慶霞，林澤榆，夏昭睿，張 雪，張國帥，李秀妍，楊志欣*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150040）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)馬錢子堿（brucine，B）進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)其具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫等作用，能夠用于人體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及腫瘤等疾病的治療中[1-3]，并且其對(duì)于人體的神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等都有一定的藥理作用[4]。秦建民等[5-7]通過體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿可明顯控制肝癌SMMC-7721 細(xì)胞和人HepG2 肝癌細(xì)胞的繁殖，阻止癌細(xì)胞的活動(dòng)和入侵，這說明B對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡有一定的作用。朱建偉等[8]在對(duì)馬錢子堿進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)還具有較強(qiáng)的止痛的作用。但是由于馬錢子堿具有毒性大、水溶性差、生物利用度低等缺點(diǎn)臨床應(yīng)用受到了限制，故亟需一種能夠降低藥物不良反應(yīng)，提高生物利用度的遞藥系統(tǒng)來使其更好的應(yīng)用于臨床[9]。而納米制劑作為如今中藥制劑領(lǐng)域一個(gè)重要的研究方向，具有提高生物利用度、降低毒性、實(shí)現(xiàn)靶向給藥等優(yōu)點(diǎn)，能夠改善馬錢子臨床用藥困難的缺點(diǎn)[10]。近年來也出現(xiàn)了將馬錢子堿制成脂質(zhì)體并成功改善其臨床用藥困難的相關(guān)研究[11-12]。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是乳酸與羥基乙酸通過聚合作用而獲得的一種高分子的化合物，具有相容性、可降解性等諸多特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域、制藥領(lǐng)域和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域[13-17]。目前美國已經(jīng)把該物質(zhì)劃分為可以在人體內(nèi)注射的生物材料之一，因此該物質(zhì)能夠用于人體疾病的治療。近年來其在納米制劑載體方面也具有良好的表現(xiàn)[18]。

課題組前期成功采用沉淀法制備了馬錢子堿聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒（B-PLGA），并對(duì)其制備工藝、表征及體外釋藥進(jìn)行了研究[19]。成功制備了形態(tài)良好可控，且具有一定緩釋效果的納米粒。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法建立馬錢子堿含量測(cè)定方法，并通過尾靜脈注射后各時(shí)間點(diǎn)眼眶取血測(cè)定其含量得到藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為其進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)的SD 大鼠12 只（200±20 g，6 ～7 周），雌雄各半，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物與試劑 馬錢子堿對(duì)照品（批號(hào)：110706-200505），質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，中國食品藥品檢定研究院；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥有限公司）；泊洛沙姆188（F68），德國BASF 公司；甲醇，色譜純，北京DIKMA 公司。

1.3 主要儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀系統(tǒng)，美國Waters 公司；FA1204B 分析電子天平，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；BYN200-2 氮?dú)獯蹈蓛x，上海秉越電子儀器有限公司；TGL-10B 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；WH-2 微型渦旋混合器，上海滬西分析儀器廠有限公司。

2 方法

2.1 B-PLGA 納米粒的制備 稱取25 mg 的PLGA 共聚物，將其放入到10 mL 的丙酮中，超聲使其溶解，作為有機(jī)相。稱取1.2 mg 藥物加入有機(jī)相中，再次超聲使其充分溶解。配制20 mL 以0.05%的F68 為穩(wěn)定劑的水溶液，將其作為水相。將有機(jī)相加入到水相中并將其放在轉(zhuǎn)速為1 000 rpm 的磁力攪拌30 min。將溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中除去有機(jī)溶劑，即得B-PLGA 納米粒溶液。

2.2 B-PLGA 納米粒微觀形態(tài) 取一定量的B-PLGA納米粒溶液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后滴入覆有支持膜的銅網(wǎng)上，待其自然干燥后，滴加2%的磷鎢酸溶液，染色2 ～3 min，置于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 粒徑與Zeta 電位的測(cè)定 取出0.1 mL B-PLGA 納米粒溶液，用蒸餾水稀釋50 倍，取適量放入激光粒度分析儀中測(cè)定粒徑、Zeta 電位。

2.4 包封率與載藥量的測(cè)定 采用低溫超速離心發(fā)測(cè)定其包封率載藥量。取出2 mL 的B-PLGA 納米粒混懸液，并將其放置在離心機(jī)中，15 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心30 min，將沉淀的納米粒收集，再用蒸餾水超聲使其分散，繼續(xù)離心，重復(fù)3 次，制成B-PLGA 混懸液。從準(zhǔn)備好的B-PLGA 混懸液精確量取需要計(jì)量的溶液，將其加入到色譜甲醇中，在40 KHz、200 W 的環(huán)境下超聲20 min，使納米粒破乳將包載的藥物充分釋放，將處理后的溶液用孔徑為0.22 μm 的過濾膜過濾后得到B-PLGA 納米粒供試品溶液，用同樣的方法制取PLGA 空白納米粒溶液。采用高效液相色譜法在甲醇:水-乙酸-三乙胺（230:2.4:0.3）= 30:70、Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱、256 nm檢測(cè)波長(zhǎng)、1 mL/min 流速、進(jìn)樣量10 μL、柱溫30 ℃條件下進(jìn)樣。計(jì)算其包封率和載藥量。

2.5 馬錢子堿含量測(cè)定方法建立

2.5.1 馬錢子堿對(duì)照品溶液制備 首先稱取2.64 mg 的馬錢子對(duì)照品，將其加入到25 mL 的容量瓶中，向其中加入甲醇定容，此時(shí)溶液的濃度為105.6 μg/mL，用甲醇依次稀釋至52.80、26.40、13.20、6.60、3.30、0.66 μg/mL，備用。

2.5.2 色譜條件 流動(dòng)相為甲醇:水-乙酸-三乙胺（230:2.4:0.3）= 30:70，色譜柱為Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，流速為（1 mL/min），進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為25 ℃。

2.5.3 血漿樣品的處理方法 取大鼠血漿250 μL，加入內(nèi)標(biāo)（20 μg/mL 士的寧甲醇溶液）20 μL，加入100 μL的NaOH 溶液（1 mol/L），渦旋1 min，超聲20 min，放入2 mL 萃取劑（二氯甲烷 : 甲醇=9 : 1），渦旋5 min，超聲溶解20 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速5 000 r/min），收集下層液，上層血漿繼續(xù)加2 mL 萃取劑，重復(fù)上述操作，合并兩次下層液，置于37 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，?00 μL色譜甲醇復(fù)溶，渦旋2 min，12 000 rpm 離心10 min，取上清液在“2.5.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.5.4 專屬性試驗(yàn) 取空白血漿、含B 對(duì)照品血漿和內(nèi)標(biāo)物士的寧對(duì)照品的血漿、尾靜脈注射藥品后的血漿樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下進(jìn)行處理。

2.5.5 線性關(guān)系的考察 精密量取“2.5.1”項(xiàng)下各濃度B 對(duì)照品溶液，氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑，加入等量空白大鼠血漿得到52.80、26.40、13.20、6.60、3.30、0.66 μg/mL 一系列濃度供試品溶液，按照“2.5.3”項(xiàng)血漿樣品處理方法對(duì)其進(jìn)行處理，在“2.5.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣檢測(cè)。記錄其色譜圖與峰面積。

2.5.6 最低定量限 將B 對(duì)照品溶液用甲醇進(jìn)行不斷稀釋，并在“2.5.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定其最低定量限。

2.5.7 精密度與回收率 分別取52.80、13.20、0.66 μg/mL的B 對(duì)照品溶液（分別為高、中、低濃度組）200 μL，氮?dú)獯蹈墒褂袡C(jī)溶劑揮發(fā)完全，將其加入到等量的空白血漿中稀釋，依次按照“2.5.3”處理，并按“2.5.2”的方法在1 d 內(nèi)和3 d 內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣分析，計(jì)算其精密度與回收率。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別量取52.80、13.20、0.66 μg/mL的等量B 對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)平行樣，氮?dú)獯蹈墒谷軇]發(fā)完全后加入等量的大鼠空白血漿，室溫25℃放置， 4、8、12 h 后取樣，分別將取出的血漿按照“2.5.3”項(xiàng)下進(jìn)行處理，在“2.5.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得出其RSD 值。

2.6 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 本實(shí)驗(yàn)中共有雌性和雄性大鼠各6 只，將這些大鼠隨機(jī)分成2 組，分別是B 溶液組（將馬錢子堿溶于含有10%乙醇的生理鹽水溶液中即得）和B-PLGA 納米粒組。在給藥前12 h 禁食不禁水，采用尾靜脈注射的方式進(jìn)行給藥，給藥劑量為10 mg/kg。于10、30、60、90、120、150、180、210、240、300、420 min 眼眶靜脈叢取血，取血量約為0.5 mL；置于肝素化離心管中。5 000 r/min離心15 min后取出其上清液，按照“2.5.3”項(xiàng)下進(jìn)行處理，在“2.5.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析后對(duì)其血液中的藥物濃度進(jìn)行計(jì)算。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過DAS 2.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 B-PLGA 納米粒表征結(jié)果

3.1.1 微觀形態(tài) 透射電鏡結(jié)果，如圖1。B-PLGA 納米粒呈類球型，粒徑為100 nm 左右，粒子清晰可見。

圖1 B-PLGA 納米粒透射電鏡圖

3.1.2 粒徑與Zeta 電位測(cè)定結(jié)果 粒徑與Zeta 電位測(cè)定結(jié)果，如圖2。平均粒徑為 （99.80±1.11） nm，PDI 為 0.112±0.045，Zeta 電位為 （-27.6±0.32） mV。

圖2 馬錢子堿PLGA 納米粒的粒徑與Zeta 電位圖

3.1.3 包封率與載藥量測(cè)定結(jié)果 按上述方法測(cè)定3批B-PLGA，得到其平均包封率為 （67.35±1.24）%，載藥量為 （2.83±0.06）%。

3.2 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 專屬性實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，如圖3。由圖可知血漿樣品處理的過程中未引入干擾物質(zhì)，血漿的內(nèi)源性物質(zhì)按此方法測(cè)定無干擾，說明該方法專屬性良好。

圖3 高效液相色譜圖

3.2.2 線性關(guān)系的考察結(jié)果 將橫坐標(biāo)（X）和縱坐標(biāo)（Y）分別設(shè)置為B 質(zhì)量濃度和對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，利用加權(quán)最小二乘法對(duì)其進(jìn)行計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y= 0.038X+0.084，R2= 0.998。結(jié)果表明濃度在0.66 ～52.80 μg/mL 范圍內(nèi)，二者呈良好的線性關(guān)系，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2.3 最低定量限結(jié)果 結(jié)果顯示最低定量限（S/N =10）為0.660 μg/mL，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定要求。

3.2.4 精密度與回收率結(jié)果 精密度及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬錢子堿不同濃度的精密度與回收率均良好，符合生物樣品的測(cè)定要求，能夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。靜脈注射B 與B-PLGA 納米粒后的藥-時(shí)曲線均符合權(quán)重因子為1/C2的二室模型，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表4。

表1 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n = 3）

表2 B 溶液組各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度

表3 B-PLGA 組各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度

表4 馬錢子堿和B-PLGA 納米粒大鼠藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n = 6）

3.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RSD 值均小于5%，說明溶液12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，可用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.3 藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果

3.3.1 藥時(shí)曲線 根據(jù)不同時(shí)間中取出的血液計(jì)算其藥物濃度，計(jì)算得出B 溶液組、B-PLGA 納米粒在各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度結(jié)果，見表2 和表3。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，藥物濃度為縱坐標(biāo)繪制出的血藥濃度-時(shí)間曲線，結(jié)果如圖4。

圖4 馬錢子堿和B-PLGA 納米粒在大鼠體內(nèi)藥時(shí)曲線（n = 6）

3.3.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 通過DAS 2.0 軟件對(duì)上文中的曲線進(jìn)行擬合，通過F 檢驗(yàn)和AIC 的值可以判定大鼠尾

從表中能看出，B-PLGA 納米粒組與B 溶液組相比較，其AUC 值、Tl/2a值和T1/2β值均明顯的增大，而CL 值顯著下降。B-PLGA 納米粒組的tl/2a值、t1/2β值分別是B 溶液組的3.13、2.89 倍，AUC 值是B 溶液組的2.42倍，CL值是B生理鹽水組的0.37倍。綜上可以發(fā)現(xiàn)，將B 制備成B-PLGA 納米粒后，大大地改變了其原本的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，延長(zhǎng)藥物在機(jī)體的生物半衰期及滯留時(shí)間，使其可以發(fā)揮長(zhǎng)效的治療作用。

4 討論

為建立合理的大鼠血漿中馬錢子堿含量的HPLC法，本研究通過預(yù)實(shí)驗(yàn)考察不同的色譜條件對(duì)含量測(cè)定的影響，當(dāng)選擇流動(dòng)相為甲醇-含乙酸和三乙胺的混合水溶液（每230 mL 水中含乙酸 2.4 mL、三乙胺0.3 mL）（30 : 70，V/V）、檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm、流速為 1 mL/min、柱溫為 25 ℃時(shí)，馬錢子堿色譜峰的峰形明顯區(qū)分度高，并且血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響馬錢子堿含量測(cè)定，故選擇上述色譜條件進(jìn)行HPLC 法建立。

體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，B 溶液組與B-PLGA組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比，具有顯著性差異，B 制備成納米粒后，清除率降低，藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，原因可能是游離的馬錢子堿作為小分子藥物，主要通過擴(kuò)散作用釋放到介質(zhì)中，發(fā)揮作用較快；而B-PLGA 納米粒主要通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞后由內(nèi)核結(jié)構(gòu)的解聚釋放藥物，發(fā)揮作用比游離的藥物要慢，同時(shí)載體有效的保護(hù)了藥物，避免被酶類分解，因此藥物在機(jī)體的生物半衰期及滯留時(shí)間有所延長(zhǎng)并提高了馬錢子堿生物利用度，提高其緩釋作用。同時(shí)有研究表明，納米級(jí)藥物可在伊派爾結(jié)中大量聚集，通過淋巴結(jié)中的M 細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，從而改變了藥物吸收途徑及藥動(dòng)學(xué)[20]，為B-PLGA 納米粒的后續(xù)研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

5 小結(jié)

綜上所述，本文成功制備了表征良好的B-PLGA納米粒，并通過體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)推測(cè)實(shí)驗(yàn)室制備的B-PLGA 納米粒能夠明顯改變B 代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)，降低清除率，延長(zhǎng)B 在大鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間，發(fā)揮長(zhǎng)效作用，提高了B 的生物利用度，為對(duì)其進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。