陳 宏，鄧琳千，陳 群，黃冬成，宋倩男*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，哈爾濱 150040；3.黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱 150030；4.黑龍江大三源乳品機(jī)械有限公司，哈爾濱 150001）

過(guò)敏性紫癜即變應(yīng)性紫癜（Henoch-Sch?nlein purpura，HSP），是兒童期血管疾病中，發(fā)病率最高的小血管炎性病變。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制因身體對(duì)一些易敏物質(zhì)做出異常的、過(guò)高的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致毛細(xì)血管發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，由于其脆性和通透性增加，導(dǎo)致血液從血管外滲，出現(xiàn)臨床癥狀，如非血小板減少性皮膚出血點(diǎn)，關(guān)節(jié)腫痛，腹部疼痛，消化道出血，黑便，蛋白尿等[1]。該病在7 ～14 歲的學(xué)齡前和學(xué)齡兒童中更常見(jiàn)，并且男孩比女孩發(fā)病更多。該病春秋兩季發(fā)病率高于冬夏兩季，且大多數(shù)患有HSP的兒童發(fā)病前有呼吸道感染病史[2]。中國(guó)古代沒(méi)有過(guò)敏性紫癜這一病名，根據(jù)癥狀將它歸納到中醫(yī)血證、葡萄疫、紫癜風(fēng)等范疇內(nèi)。

生地黃是雙子葉植物玄參科植物地黃的塊根[3]。地黃根莖中的化學(xué)成分以甙類(lèi)為主，還含有β-谷甾醇、地黃素、生物堿、氨基酸、糖類(lèi)、有機(jī)酸，以及維生素A 類(lèi)物質(zhì)和多種微量元素[4-5]。因其有效成分，生地黃能夠滋陰瀉熱，涼血補(bǔ)血[6]，臨床主治溫病熱入營(yíng)血，熱病后期陰虛火旺、發(fā)熱口渴、陰傷腸燥便秘，血熱嘔血、鼻衄、尿血、黑便、崩漏下血、胎動(dòng)不安等疾病。

JAK2/STAT3 通路中，JAK2 和STAT3 在Th 細(xì)胞分化中起重要作用[6]。Th1 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2 等細(xì)胞因子，可通過(guò)激活T 細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，誘導(dǎo)Th0 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)h1 細(xì)胞和抑制Th2 細(xì)胞來(lái)拮抗炎癥。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-10 等細(xì)胞因子，通過(guò)促進(jìn)免疫球蛋白E（IgE）的分泌和增加肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞誘發(fā)炎癥[7]。本文基于中草藥生地黃清熱滋陰養(yǎng)血的藥物功效，將通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到其提取物，進(jìn)而研究生地黃提取物在淋巴系統(tǒng)中抑制抗體產(chǎn)生、抑制單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的病理變化，以及抑制急性炎癥反應(yīng)的機(jī)制，以探討生地黃提取物治療HSP 的潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)5 ～6 周齡雄性ICR 小鼠60只，體質(zhì)量（25.0±2.5）g，由長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技公司提供?？刂骑曫B(yǎng)條件一致，允許小鼠自由進(jìn)食與飲水，并將其在一個(gè)通風(fēng)良好的飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。

1.1.2 儀器 Kimble 微量電動(dòng)組織勻漿器（美國(guó) Fluka公司）；Multiskan GO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Fisher 公司）；Fresco 17 微量高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；MULTIAKAN MK3 全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（美國(guó) Thermo 公司）；ZCLIPSE 50i 型光學(xué)顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon 公司）；Powerpac Univeal通用型電泳儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）；DFM-60D 倒置熒光顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）。

1.1.3 藥品試劑 生地黃干燥的塊根；西咪替丁（哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H230229）；麥膠蛋白（東京化成工業(yè)股份有限公司）；兔抗大鼠NF-κB p65 多克隆抗體（BA0610）（英國(guó) Abcam 公司）；SV-0002 兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；p-JAK2、p-STAT3 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Immunoway 公司）；ELISA 檢測(cè)試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生地黃提取物的制備 將生地黃干燥的塊根研磨成粉，準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g，將生地黃粉置于索氏提取器中，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇為提取劑，在原料（g）溶液（mL）在1 : 20 的條件下，回流2 h，提取2 次，混合，進(jìn)行過(guò)濾，并減壓濃縮，得到乙醇提取物。再將其轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入200 mL 蒸餾水，混合均勻制成懸浮液。然后依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每級(jí)重復(fù)3 次，依次得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物。

1.2.2 小鼠分組、模型構(gòu)造與給藥方法 將60 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，按隨機(jī)數(shù)字表法平均分成對(duì)照組、模型組、西咪替丁組、生地黃提取物低、中、高劑量組，每組各10 只。除對(duì)照組小鼠外，其余小鼠造模HSP，方法如下[8]，于小鼠尾部進(jìn)行靜脈注射40 mg/kg 印度墨汁7 日1 次，連續(xù)注射21 d。采用尾靜脈注射印度墨水結(jié)合麥膠蛋白灌胃建立HSP 模型。將0.1%麥膠蛋白溶于6 mmol/L HCl 酸化水，連續(xù)14 周，每2 日1 次灌胃小鼠該溶液。在灌胃結(jié)束前3 天，改為每日1次0.2 mL/20 g 的麥膠蛋白溶液，尾部靜脈注射，而在模型組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)的相同時(shí)間，對(duì)照組尾部靜脈注射接受相同量的6 mmol/L HCl 酸化水。模型成功標(biāo)準(zhǔn)[9]：皮下出現(xiàn)紫癜，顯微鏡下可見(jiàn)局灶性上皮細(xì)胞增多和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟發(fā)生病理改變。

成功后，小鼠按實(shí)驗(yàn)要求每日灌胃1 次等量實(shí)驗(yàn)溶液，西咪替丁組灌胃0.1 g/mL 西咪替丁溶液，生地黃提取物低、中、高劑量組灌胃給藥體積依次為10 mg/mL、20 mg/mL 和30 mg/mL 溶液，模型組和對(duì)照組灌胃生理鹽水，連續(xù)21 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 腎組織病理學(xué)檢測(cè) 通過(guò)石蠟包埋將腎組織標(biāo)本處理以制備成組織切片，之后進(jìn)行過(guò)碘酸雪夫染色。從每組切片中隨機(jī)選取10 個(gè)腎小球和腎小管間質(zhì)區(qū)，在高倍視野（×400）下，根據(jù)系膜增生面積等表現(xiàn)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，并計(jì)算每組10 個(gè)視野發(fā)生損害組織學(xué)評(píng)分的平均值 。觀察腎小球和腎小管間質(zhì)病理改變。并將另一個(gè)腎臟組織置于液氮中，凍透后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6 水平測(cè)定 小鼠麻醉后，注射針連續(xù)多次股動(dòng)靜脈取血，每只小鼠約3 mL，取其中1 mL 血靜置15 ～30 min， 3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，提取血清，貯存于4℃冰箱，避光保存。測(cè)定時(shí)移至常溫解凍30 min，參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)各組小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的水平。

1.3.3 小鼠腎組織 p-JAK2、p-STAT3 相對(duì)蛋白的表達(dá)情況 取新鮮凍存腎臟組織0.05 g 加入蛋白裂解液0.5 mL，用勻漿器在冰上將腎臟組織勻漿并在冰上裂解20 min 后于4 ℃ 15 000 r/min離心15 min 收集上清液，考馬斯藍(lán)法測(cè)蛋白定量。定量提取到的蛋白后，在緩沖液中煮沸，使蛋白變性，取20 μg 上樣，300 mA 橫流轉(zhuǎn)模3 h，3%BSA 封閉30 min，加入一抗p-JAK2、p-STAT3，4 ℃維持過(guò)夜。次日，3 min×5 次TBST 洗膜，加入HRP 結(jié)合的二抗（1 : 10 000），室溫下孵育2 h，3 min×6 次TBST 洗膜。使用超敏型 ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒。使用Total Lab Quant 凝膠定量分析軟件，用于讀取條帶的IOD值。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參物，Image軟件分析并計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 26.0 軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；滿足正態(tài)性及方差齊性的組間比較采用單因素方差分析；不滿足正態(tài)性或方差齊性的組間比較采用Kruskal Wallis 檢驗(yàn)。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用Dunnett 法進(jìn)一步兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，2 組之間比較采用χ2或Fisher 確切概率檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α = 0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎臟組織病理學(xué)改變比較 如圖1。

圖1 各組小鼠腎臟組織病理學(xué)改變比較

2.2 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 水平比較 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 水平比較（±s，n = 10） pg/mL

表1 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 水平比較（±s，n = 10） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05；與西咪替丁組、生地黃提取物低、中劑量組比較，▲P ＜0.05

組別IFN-γIL-2IL-4IL-10對(duì)照組226.93±32.4874.92±14.36 68.73±15.1652.84±14.36模型組105.21±20.65##39.18±8.06##242.49±40.21##105.52±21.58##西咪替丁組142.97±25.61#△45.23±9.04#△186.75±32.04△89.78±16.02#△生地黃提取物高劑量組214.37±31.03#△▲70.28±10.25#△▲ 78.86±15.42#△▲56.84±11.53#△▲生地黃提取物中劑量組197.42±28.34#△52.16±9.74#△124.37±28.54#△73.16±13.82#△生地黃提取物低劑量組145.39±26.73##△44.93±8.75#△173.42±31.65#△87.48±14.36##△

2.3 各組小鼠腎組織 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2 和圖2。

表2 各組小鼠腎組織 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)比較（x ± s，n = 10）

圖2 各組小鼠腎組織 p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達(dá)比較

3 討論

HSP 的發(fā)生與外邪侵襲、飲食失調(diào)、血瘀、久病體弱等因素相關(guān)[9]。伏熱在內(nèi)，外感時(shí)邪，其主要病機(jī)為熱入血分，迫血妄行，血不循經(jīng)，而發(fā)為紫癜[10]。本病早期多為風(fēng)熱侵襲，損傷血絡(luò)，血熱妄行，以陽(yáng)、熱、實(shí)證為主要的癥狀。病之初多實(shí)，故初為實(shí)證；病久則由實(shí)轉(zhuǎn)虛，因正虛而發(fā)病者均屬虛證；或由于病情復(fù)雜，既有虛象又有實(shí)象，形成虛實(shí)夾雜證。與心、脾、肺三臟密切相關(guān)，也可涉及肝、腎[11]。根據(jù)紫癜的發(fā)病快慢、病程長(zhǎng)短、顏色深淺等方面區(qū)分病情的虛和實(shí)[12-13]。發(fā)病迅速，病程短，紫癜鮮明色深的患者，多為實(shí)證。發(fā)病緩慢，病程長(zhǎng)，紫癜病情反復(fù)，顏色淺的患者，多為虛證。治療原則以清熱涼血、解毒化瘀為主[14]。如風(fēng)熱傷絡(luò)者，宜祛風(fēng)清熱，涼血安絡(luò)；濕熱痹阻者，宜清熱祛濕，活血通絡(luò)[15]；胃腸積熱者，宜瀉火解毒，清胃除斑；熱在血分者，宜清熱解毒，涼血化瘀；恢復(fù)期氣陰兩虛者，多用益氣養(yǎng)血，滋陰涼血之藥，以恢復(fù)患者損害的氣陰[16]。

有學(xué)者[17]的經(jīng)驗(yàn)治療HSP 常用犀角地黃湯隨證加減，其方中以犀角（水牛角替）、生地黃、牡丹皮、赤芍為主要有效藥物。其中作為基本藥材之一的生地黃，以其清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效見(jiàn)長(zhǎng)。近年，國(guó)內(nèi)和國(guó)際研究人員專(zhuān)注于尋找植物中可清除自由基的有效成分，對(duì)植物中各種活性成分（如酚類(lèi)和黃酮類(lèi)）的抗氧化和抗炎活性的研究也在增加。生地黃的提取物不但具有促止血的作用，還具有強(qiáng)心、利尿的作用，主要作用部位在于心肌[18]。地黃酒中生地黃與益母草同用，治療血熱崩漏或產(chǎn)后出血、心神不寧者。生地黃若與知母、地骨皮一起使用，可治虛煩內(nèi)熱以及糖尿病消渴癥狀，由于其強(qiáng)心、利尿的作用，使熱從小便而出，利水道引熱下行從而可達(dá)到清解熱邪的作用，如益胃湯。

JAK/STAT 信號(hào)通路是一條新近研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制途徑。該通路可激活刺激機(jī)體細(xì)胞，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和免疫調(diào)節(jié)，并與多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子相關(guān)[19]。其中JAKI/2 和TYK2 是一類(lèi)獨(dú)特的非受體型酪氨酸蛋白激酶，廣泛存在于機(jī)體各種組織中，而特殊的JAK3 僅存在于骨髓和淋巴系統(tǒng)內(nèi)[20]。

綜上所述，生地黃提取物對(duì)HSP 小鼠具有顯著的抗氧化活性和抗炎作用，其治療HSP 可能是通過(guò)抑制JAK2/STAT3 途徑的激活，來(lái)影響p-JAK2 和p-STAT3蛋白的表達(dá)情況，從而達(dá)到減輕小鼠HSP 癥狀的目的。但研究尚存在不足，未設(shè)置通路激活劑組進(jìn)行驗(yàn)證，且由于觀察期較短，本研究未能進(jìn)一步探討其他客觀指標(biāo)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，仍需要更長(zhǎng)的隨訪期來(lái)進(jìn)一步研究其對(duì)疾病的預(yù)后是否具有影響。