胡 程，宋浩穎，常 聰，邱振鵬，鄭國華,2，孟 燕,*

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢 432500；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 432500）

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，許多金屬及非金屬的無機(jī)納米顆粒被用于各種疾病的治療。其中，納米硒（Se NPs）因其毒性低、生物利用度高、活性高成為硒類物質(zhì)研究和發(fā)展的焦點(diǎn)。但純的 Se NPs 不穩(wěn)定，在水溶液中容易聚集，因此為保持其良好的水溶性和穩(wěn)定性，在制備過程一般要添加分散劑或保護(hù)劑使其在水溶液中穩(wěn)定分散[1-4]?；瘜W(xué)類表面活性劑雖然對(duì)納米硒有較強(qiáng)的分散能力，但因其本身的毒性使納米硒在生物活性方面的應(yīng)用受限[5]。核酸、蛋白質(zhì)和多糖等天然生物大分子，由于其本身的生物相容性好，被更為廣泛地用于構(gòu)建生物醫(yī)用材料。如Meng 等[6]利用多糖-亞硒酸鈉螯合法制得一種新型的水溶性黃芪多糖納米硒（Se-APS）。結(jié)果表明，Se-APS 含硒量高、水溶性好、副作用小，不僅能夠促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的增殖，還能夠抑制HepG2 細(xì)胞的惡性增殖，減少細(xì)胞的遷移和侵襲。Zhu 等[7]探討了石筍多糖（ULP）穩(wěn)定的Se NPs 對(duì)DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎產(chǎn)生保護(hù)作用。因此，開發(fā)多糖-納米硒復(fù)合物對(duì)臨床疾病的治療具有重要的意義。

黑木耳是生長(zhǎng)在朽木上的一種腐生菌，具有補(bǔ)脾益氣、止咳潤(rùn)肺、延緩衰老、輔助降血糖降血脂及抗癌等功效[8]。黑木耳的主要活性成分為多糖，目前已有多篇研究報(bào)道了從黑木耳中提取得到的不同結(jié)構(gòu)的多糖，并證明了他們具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等功效[9-13]。在本課題組前期研究中，發(fā)現(xiàn)從黑木耳中提取的一種多糖，可在水中自組裝成樹枝狀納米管（DNTs）[14-17]，這種中空納米管結(jié)構(gòu)可以負(fù)載多種客體分子，如DOX 藥物、Pt（IV）前藥、聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）染料以及金、銀納米粒子[14,16-18]。并在治療中展現(xiàn)出優(yōu)良的療效[19]。然而，該復(fù)合物作為一種新型制劑，其制備工藝并未進(jìn)行過系統(tǒng)研究，阻礙其作為藥物的深入開發(fā)。

因此，本文擬通過系統(tǒng)的制備工藝考察來探索DNT-Se 復(fù)合物的最優(yōu)制備條件。有研究表明，在納米硒的制備工藝中，多糖濃度、維生素C 與亞硒酸鈉的比例、反應(yīng)溫度等都是制備理想納米顆粒的重要因素[20]。因此，本文對(duì)黑木耳β-葡聚糖/納米硒復(fù)合物（DNT-Se）的制備工藝進(jìn)行考察，主要研究黑木耳β-葡聚糖溶液濃度、維生素C 和亞硒酸鈉配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、亞硒酸鈉濃度等反應(yīng)條件對(duì)DNTSe 復(fù)合物粒徑的影響，采用單因素考察結(jié)合正交試驗(yàn)進(jìn)行比例篩選，從而確定制備DNT-Se 的最佳工藝，并考察其對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞增殖的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑木耳 湖北房縣；乙酸乙酯 天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇、無水乙醇、維生素C、亞硒酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氘代二甲基亞砜、溴化鉀 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Cell Counting Kit-8東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、雙抗（青霉素-鏈霉素溶液）、胰酶（0.25%）、磷酸鹽緩沖液 美國HyClone 公司；胎牛血清（FBS） 美國Gbico 公司；二甲亞砜（DMSO） 美國Sigma 公司；人胚胎腎細(xì)胞株293T、小鼠正常肝細(xì)胞株AML-12 及人肝癌細(xì)胞株HepG2 購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

Implen N60 超微量紫外分光光度計(jì) 北京諾匯誠生物科技有限公司；Nicolet 6700 傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；YP-2 壓片機(jī) 上海山岳科學(xué)儀器有限公司；Mercury VX-300 核磁共振儀 Varian Mercury 公司；LC-10A 高效液相色譜儀、RI-10A 示差檢測(cè)器 Shimadzu；色譜柱BRT105-104-102 串聯(lián)凝膠柱 BRT105-104-102 （8 mm×300 mm） BoRuiSaccharide；Nano-ZS90 粒徑測(cè)定儀 馬爾文儀器有限公司；JEM1400 透射電鏡 日本JEOL 有限公司；QUANTA200 掃描式電子顯微鏡 FEI 公司；XPertPro X 射線衍射儀 荷蘭帕納科公司；ESCALAB250Xi X 射線光電子能譜儀 Thermo FisherScientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳β-葡聚糖的提取、分離及表征 按照參考文獻(xiàn)[21]的方法，黑木耳粉碎后，分別使用丙酮、乙酸乙酯回流4 h 脫脂，將脫脂粉末烘干后使用70%乙醇溶脹24 h 后用0.9% NaCl 提取，收集上清，然后使用Sevage 法脫蛋白、H2O2脫色，透析7 d后凍干即得黑木耳多糖。按照參考文獻(xiàn)[22]的方法，采用苯酚-硫酸法對(duì)黑木耳β-葡聚糖的總糖含量進(jìn)行測(cè)定。將凍干的黑木耳多糖配制成多糖溶液，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液在490 nm 處的吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總糖含量。使用傅里葉紅外光譜儀，采用溴化鉀壓片法采集黑木耳β-葡聚糖的紅外光譜，檢測(cè)范圍為400～4000 cm-1。另取30 mg 黑木耳β-葡聚糖凍干品溶于1 mL 氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）中，置于核磁儀上進(jìn)行測(cè)定以得核磁共振（NMR）譜圖，測(cè)定溫度為25 ℃。

1.2.2 黑木耳β-葡聚糖/納米硒復(fù)合物（DNT-Se）的制備 將β-葡聚糖于60 °C 溶于蒸餾水（1 mg/mL）,冷卻至室溫，即可通過其在水中自組裝得黑木耳β-葡聚糖納米管，命名為DNTs。純納米硒對(duì)照組（Se NPs），采用VC還原法制備。將VC水溶液（1 mg/mL）以4:1（n/n）的比例逐滴滴加到亞硒酸鈉水溶液中，即可得到納米硒粒子，命名為Se NPs。DNT-Se 的制備方法類似，將黑木耳β-葡聚糖配制成終濃度1 mg/mL的多糖溶液，待完全溶解后逐滴滴加0.1 mol/L 的亞硒酸鈉（Na2SeO3）水溶液，攪拌30 min 后再按照維生素C 與亞硒酸鈉配比為4:1（n/n）逐滴滴加維生素C 水溶液（1 mg/mL），于25 ℃反應(yīng)24 h。之后轉(zhuǎn)入透析袋中（MWCO 3000）透析，冷凍干燥即得多糖/納米硒復(fù)合物，命名為DNT-Se。

1.2.3β-葡聚糖/納米硒復(fù)合物中納米硒粒徑的評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.2.3.1 雙波長(zhǎng)吸光度比值法 將濃度為1 mg/mL DNTs、1 mg/mL 維生素C 溶液以及1 mg/mL 維生素C+1 mg/mL DNTs（v/v=1:1）、1 mg/mL DNTs+1 mg/mL 維生素C+1 mol/L 亞硒酸鈉溶液（v/v/v=1:1:1），進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描（200～800 nm），確定波長(zhǎng)λ1（410 nm）、λ2（490 nm）的吸光度A1、A2，并計(jì)算A1/A2的值，以各因素為橫坐標(biāo)，以波長(zhǎng)比（A1/A2）為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖，以比值大小判斷DNT-Se 復(fù)合物中Se NPs 的粒徑大小，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2.3.2 粒徑儀測(cè)定法 將所得的DNT-Se 置于馬爾文激光粒度儀中，穩(wěn)定120 s，于25 ℃下測(cè)定DNT-Se復(fù)合物中Se NPs 的粒徑，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2.4 DNTs-Se 粒徑的單因素考察 分別考察DNTs濃度、亞硒酸鈉濃度、維生素C 與亞硒酸鈉配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)DNT-Se 形成的影響。分別配制濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的DNTs 溶液，其他條件保持不變，考察DNTs 濃度對(duì)DNT-Se形成的影響；保持其他條件不變，考察0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L 的亞硒酸鈉溶液對(duì)DNT-Se 形成的影響；精密稱取維生素C 與亞硒酸鈉，使二者終配比為2:1、3:1、4:1、5:1、6:1（n/n 物質(zhì)的量之比），考察維生素C 與亞硒酸鈉配比對(duì)DNT-Se 形成的影響；分別考察反應(yīng)溫度為25、37、60、80 ℃時(shí)對(duì)DNTSe 形成的影響；在保持其他條件不變的條件下分別考察反應(yīng)3、6、12、24、36 h 對(duì)DNT-Se 形成的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化DNT-Se 的制備工藝 以DNTs-Se 中Se NPs 粒徑大小的單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選取三種因素作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將最適宜的條件作為中間水平，以L9（34）設(shè)計(jì)正交因素水平表為模板，按照表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，以對(duì)DNT-Se 的制備進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

表1 正交設(shè)計(jì)中的因素與水平Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.2.6 黑木耳β-葡聚糖/納米硒復(fù)合物（DNT-Se）的形貌表征 DNT-Se 的形貌特征通過透射電子顯微鏡（TEM）來觀察。取一滴新制備的DNTs、Se NPs及DNT-Se 溶液分別小心滴于100 目的銅網(wǎng)上，待樣品被吸附10 min 后，用濾紙吸走各剩余樣品溶液，室溫下晾干銅網(wǎng)，通過TEM 觀察依次各樣品的微觀形態(tài)。同時(shí)用能量色散光譜儀對(duì)其表面積斷面進(jìn)行觀察，加速電壓為5 kV，測(cè)試前均進(jìn)行噴金操作。

1.2.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK8 法[23]檢測(cè)DNTSe 等樣品對(duì)各種細(xì)胞增殖抑制的情況。首先采用該法檢測(cè)DNTs、Se NPs 及DNT-Se 對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞的增殖抑制情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞消化，加適量完全培養(yǎng)基輕吹散成細(xì)胞懸液，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)以便進(jìn)行密度換算。將細(xì)胞混懸液稀釋后以1.0×104個(gè)/孔的密度分別接種于96 孔板內(nèi)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中待其貼壁。貼壁后將含有一定濃度梯度的DNTs、Se NPs、DNT-Se 培養(yǎng)基（6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）分別加入到各孔中，同時(shí)建立無藥物、無細(xì)胞的空白組和無藥物、有細(xì)胞的對(duì)照組，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48、72 h。

接著采用該法檢測(cè)DNT-Se 對(duì)293T 人胚胎腎細(xì)胞及AML-12 小鼠正常肝細(xì)胞活性的影響，以進(jìn)一步確定DNT-Se 的生物安全性。將293T 細(xì)胞和AML-12 細(xì)胞以1×105的密度接種于96 孔板，待其貼壁。之后加入含有一定濃度梯度的DNT-Se 培養(yǎng)基（6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL），同時(shí)建立無藥物、無細(xì)胞的空白組和無藥物、有細(xì)胞的對(duì)照組，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

以上三種細(xì)胞終止培養(yǎng)后，每孔加入無菌PBS清洗細(xì)胞2 次以洗凈培養(yǎng)基，再加入100 μL 含10%CCK8 培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20 min，最后用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)每孔的吸光度OD 值。用下式計(jì)算各細(xì)胞的存活率，用Graphpad prism 7.0 計(jì)算藥物的半數(shù)致死濃度（IC50）：

細(xì)胞存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Graph Pad Prism 7.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s ）表示，多組間均數(shù)采用 One-Way ANOVA 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳β-葡聚糖的理化性質(zhì)表征

所得多糖采用苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為94.1%，因前期[24-25]已通過色譜洗脫、甲基化分析等手段對(duì)黑木耳β-葡聚糖的平均高度、長(zhǎng)度、分子量、鏈構(gòu)象等進(jìn)行了詳細(xì)的表征，故本文僅對(duì)該多糖進(jìn)行初步驗(yàn)證并與之對(duì)比，從而確證二者的相似性。紅外光譜圖如圖1A 所示。由圖1A 可知，黑木耳葡聚糖在890 cm-1處有明顯的吸收峰，為β構(gòu)型的特征峰[26]，結(jié)合前期研究，該黑木耳多糖為β-葡聚糖。

圖1 黑木耳β-葡聚糖的近紅外圖譜（A）、核磁共振氫譜（B）、核磁共振碳譜（C）及其結(jié)構(gòu)式（D）Fig.1 FT-IR spectrum (A) , 1H NMR spectrum (B) ，13C NMR spectrum (C) and structural formula (D) of β-glucan from Auricularia auricula

采用核磁共振氫譜和碳譜分析黑木耳β-葡聚糖的連接方式。如圖1B 和圖1C 所示，在13C 核磁共振譜中未發(fā)現(xiàn)典型的糖醛酸信號(hào)（176.5 ppm），表明β-葡聚糖是中性多糖。黑木耳β-葡聚糖在74.26 ppm處C2t 積分值（側(cè)鏈）和在72.99 ppm 處C2（主鏈）積分值的比值為1:1.4，DNTs 的所有化學(xué)位移如表2所示。與前期報(bào)道黑木耳多糖[27-29]的NMR 特征峰等進(jìn)行對(duì)比可確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)為主鏈上每三個(gè)β-（1,3）-葡萄糖主鏈帶有兩個(gè)β-（1,6）-葡聚糖的側(cè)鏈，具體結(jié)構(gòu)式如圖1D 所示。

表2 黑木耳β-葡聚糖的1H 和13C NMR 化學(xué)位移Table 2 1H and 13C NMR chemical shifts of β-glucan from Auricularia auricula

2.2 黑木耳β-葡聚糖/納米硒復(fù)合物（DNT-Se）的制備工藝研究

2.2.1 不同溶液的全掃描吸收光譜 根據(jù)之前報(bào)道的膠體溶液雙波長(zhǎng)法[30-31]可知，硒納米顆粒的粒徑參數(shù)ε=lg（A2/A1） / lg（λ1/λ2），其中 A1、A2分別表示樣品在波長(zhǎng)λ1、λ2下的吸收值。可用A1/A2的比值來表征納米硒的粒徑變化，當(dāng)比值不變時(shí)，納米硒的粒徑不再發(fā)生變化；比值越大，納米硒的粒徑越小，形貌越穩(wěn)定。圖2 為不同溶液的UV-Vis 全波長(zhǎng)掃描吸收光譜。從圖中可以看出，DNTs、VC及二者的混合樣品在200～300 nm 范圍內(nèi)有明顯的吸收峰，但在300～600 nm 范圍內(nèi)無明顯吸收；而DNTs+VC+Na2SeO3（總反應(yīng)介質(zhì)）在200～600 nm 處均有吸收，且峰值較寬，說明在加入Na2SeO3后生成了一定的納米硒，因此在300～600 nm 范圍內(nèi)選取410 和490 nm作為納米硒的測(cè)定波長(zhǎng)，并以A410/A490作為表征納米硒粒徑隨時(shí)間變化的依據(jù)及指標(biāo)。

圖2 不同溶液的UV-Vis 全掃描吸收光譜Fig.2 Full-scanning UV-Vis absorption spectra of different solutions

2.2.2 單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.1 DNTs 濃度對(duì)DNT-Se 形成的影響 本試驗(yàn)以黑木耳β-葡聚糖溶液DNTs 作為模板劑，研究了DNTs 濃度對(duì)DNT-Se 復(fù)合物中Se NPs 粒徑的影響。各濃度下的吸光度比值及DNT-Se 復(fù)合物中Se NPs 的粒徑如表3 所示。隨著DNTs 濃度的增加，A410/A490的數(shù)值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在DNTs 濃度為1.0 mg/mL 時(shí)A410/A490達(dá)到最大值2.549±0.025。同時(shí)，馬爾文粒徑儀測(cè)得的結(jié)果表明，DNT-Se 復(fù)合物中Se NPs 的粒徑出現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，在1.0 mg/mL 時(shí)Se NPs 的粒徑最小。將各組溶液放置7 d 后，均未發(fā)現(xiàn)聚沉等現(xiàn)象，可初步說明各組的穩(wěn)定性良好。因此，選擇1.0 mg/mL DNTs作為反應(yīng)體系中DNTs 的濃度。

表3 不同DNTs 濃度對(duì)納米硒的粒徑及A410/A490 的影響Table 3 Effect of different DNTs concentration on the size of Se NPs and A410/A490

2.2.2.2 維生素C 與亞硒酸鈉的配比對(duì)DNT-Se 形成的影響 各配比下的吸光度比值及納米硒的粒徑如表4 所示。固定反應(yīng)體系中亞硒酸鈉的終濃度為0.1 mol/L，VC的量對(duì)反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在體系中的亞硒酸鈉是否得到完全反應(yīng)，能否生成足夠量的納米硒。判斷反應(yīng)完全的程度的最直觀的變化則是溶液顏色的深淺，越深表明納米硒生成量越多，同時(shí)，A410、A490也可能會(huì)越大并且趨于穩(wěn)定。從表4 中可以看出，隨著VC/Na2SeO3的升高，A410/A490逐漸增加，這說明溶液中越來越多的亞硒酸鈉參與了反應(yīng)；而當(dāng)比值達(dá)到5:1 之后，A410/A490呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這說明當(dāng)VC/Na2SeO3達(dá)到5:1 之后，反應(yīng)體系中的亞硒酸鈉得到了完全反應(yīng)，由于納米硒生成過多，產(chǎn)生聚集導(dǎo)致A410/A490開始減小。接著測(cè)定了各體系中納米硒的粒徑，發(fā)現(xiàn)其在VC/Na2SeO3為5:1 時(shí)的粒徑最小，該結(jié)果與雙波長(zhǎng)比值結(jié)果一致。將各組溶液放置7 d 后，均未發(fā)現(xiàn)聚沉等現(xiàn)象，可初步說明各組的穩(wěn)定性良好。結(jié)合該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故選擇VC/Na2SeO3=5:1 作為反應(yīng)體系中維生素C 與亞硒酸鈉的比例。

表4 不同VC 與Na2SeO3 的配比對(duì)納米硒的粒徑及A410/A490 的影響Table 4 Effect of different ratio of VC and Na2SeO3 on the size of Se NPs and A410/A490

2.2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)DNT-Se 形成的影響 反應(yīng)溫度不僅對(duì)納米硒粒徑的大小有影響，而且對(duì)作為穩(wěn)定劑的多糖DNTs 也有影響。因此，確定一定的反應(yīng)溫度是至關(guān)重要的一環(huán)。本試驗(yàn)研究了不同的反應(yīng)溫度對(duì)納米硒形成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5 所示。從結(jié)果中可以得知，隨著反應(yīng)溫度的升高，A410/A490逐漸降低，納米硒粒徑逐漸增加，甚至在80 ℃ 時(shí)出現(xiàn)了聚沉，因?yàn)闇囟冗^高會(huì)破壞多糖的鏈狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)其自組裝能力也會(huì)受到影響，導(dǎo)致整個(gè)反應(yīng)體系不穩(wěn)定，多糖穩(wěn)定納米硒的能力減弱[32-33]。盡管在25、37、60 ℃時(shí)均未發(fā)生聚沉，但25 ℃ 時(shí)DNT-Se 粒徑最小，因此，選擇25 ℃作為制備DNT-Se 的最佳反應(yīng)溫度。

2.2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DNT-Se 形成的影響 與反應(yīng)溫度對(duì)納米硒粒徑大小的影響一樣，反應(yīng)時(shí)間對(duì)納米硒的粒徑也有著重要影響。因此，本試驗(yàn)也探究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)納米硒形成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6 所示。從結(jié)果中可以看出，反應(yīng)時(shí)間在12 h 內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，A410/A490也逐漸增加，納米硒粒徑逐漸減??；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于12 h 時(shí)，A410/A490開始降低，納米硒粒徑增加。在反應(yīng)溫度一定時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中生成的納米硒逐漸增多，溶液的顏色會(huì)出現(xiàn)淺黃色→橙色→紅色的變化， A410/A490增加，DNT-Se 粒徑減小[34-35]。但反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，納米硒會(huì)發(fā)生集聚，硒納米粒子的粒徑增大，溶液的顏色會(huì)由紅色變?yōu)榇u紅色，甚至出現(xiàn)紅色沉淀。因此，反應(yīng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，故選擇12 h 作為制備DNT-Se的反應(yīng)時(shí)間。

表6 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)納米硒的粒徑及A410/A490 的影響Table 6 Effect of different reaction time on the size of Se NPs and A410/A490

2.2.2.5 亞硒酸鈉濃度對(duì)DNT-Se 形成的影響 本研究最主要的目的是在納米硒分散且穩(wěn)定的前提下，利用DNTs 負(fù)載盡可能多的納米硒。因此納米硒的濃度至關(guān)重要。不同亞硒酸鈉濃度對(duì)粒徑的影響如表7 所示。隨著濃度的增加，A410/A490逐漸減小，納米硒粒徑也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)；在濃度為1.2 mol/L時(shí)，樣品出現(xiàn)了聚沉現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，0.6、0.8、1.0 mol/L 的A410/A490與粒徑相差不大，結(jié)合實(shí)驗(yàn)的目的，選擇Na2SeO3為1.0 mol/L 作為反應(yīng)體系中亞硒酸鈉的濃度。

表7 不同Na2SeO3 濃度對(duì)納米硒的粒徑及A410/A490 的影響Table 7 Effect of different Na2SeO3 concentration on the size of Se NPs and A410/A490

2.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化DNT-Se 的制備工藝 基于前述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及本研究的主要目的，選擇DNTs濃度（A）、維生素C 與亞硒酸鈉的配比（B）和亞硒酸濃度（C）作為因素，選擇最適宜的條件作為中間水平，各設(shè)三個(gè)水平，第四個(gè)因素為空白組，作為本實(shí)驗(yàn)的誤差列，采用四因素三水平L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表，繼續(xù)優(yōu)化DNT-Se 的制備工藝，優(yōu)化指標(biāo)為納米硒粒徑。實(shí)驗(yàn)使用的因素水平如表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8 所示。

表8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 8 Orthogonal experimental design and results

對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果，以DNTs-Se 中Se NPs 粒徑大小為指標(biāo)，進(jìn)行直觀分析及方差分析，如表8 和表9 所示，以空白組作為誤差項(xiàng)，因素A、B、C 的F值與臨界值比較后可知，因素A 不同水平對(duì)納米硒的影響有顯著性差異，即DNTs 濃度對(duì)納米硒的影響顯著（P<0.05）。各因素對(duì)納米硒粒徑的影響程度為A>C>B。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，得出最佳方案為A2B3C3。

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 Analysis of variance of orthogonal experiment results

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 運(yùn)用正交試驗(yàn)所得的最優(yōu)條件進(jìn)行5 組實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，即DNTs 濃度1.0 mg/mL，維生素C 與亞硒酸鈉配比6:1，亞硒酸鈉濃度為1.0 mol/L。5 次驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果中納米硒粒徑分別為33.59、35.10、34.48、35.32、34.01 nm，5 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中納米硒粒徑的均值為34.50±0.72 nm。故選擇A2B3C3作為最佳制備條件。

2.3 黑木耳β-葡聚糖/納米硒復(fù)合物（DNT-Se）的形貌表征

DNTs 及Se NPs 的透射電鏡結(jié)果如圖3 所示。由圖3A 所示，DNTs 在水中可自組裝成為平均直徑約為200 nm 的樹枝狀的中空納米纖維。而沒有分散劑的純Se NPs 則聚集成團(tuán)且粒徑較大，約為220 nm（圖3B）。圖3C 和圖3D 是DNT-Se 的透射電鏡圖、粒徑分布圖。顯然，因DNTs 的存在，Se NPs 不再聚集成團(tuán)，而是均一、單一地分散于DNTs 的中空納米管中，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道相符。DNT-Se 形態(tài)良好，粒徑較小，約為30.9 nm（圖3C），而正交試驗(yàn)所得的粒徑大小約為34.50 nm，這是因?yàn)檎或?yàn)證時(shí)中測(cè)量粒徑時(shí)DNT-Se 是以一個(gè)液體的狀態(tài)存在，多糖在溶液中會(huì)有一定的體積膨脹。而透射電鏡中，DNT-Se 是處于干燥狀態(tài)的。此時(shí)的粒徑確實(shí)會(huì)與溶液狀態(tài)下粒徑大小具有一定的差異。

圖3 DNTs、Se NPs、DNT-Se 的TEM 圖像及DNT-Se 中Se NPs 的粒徑分布圖Fig.3 TEM image of DNTs, Se NPs and DNT-Se, and particle size distribution of Se NPs in DNT-Se

2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

有研究表明，含硒的材料通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌活性[33]。故為考察各樣品對(duì)肝癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的作用，本研究采用CCK8 法對(duì)DNTs、Se NPs及DNT-Se 對(duì)HepG2 細(xì)胞的作用進(jìn)行了探討。結(jié)果如圖4 所示，由圖4A 可知，DNTs 與細(xì)胞作用72 h后，在最高濃度下存活率仍高于75%，說明DNTs 基本不殺死細(xì)胞，也可推測(cè)其基本不引起細(xì)胞凋亡；由圖4B 可知，200 μg/mL 的Se NPs 與細(xì)胞作用48 h后，在最高濃度下存活率大于92%，而當(dāng)其作用時(shí)間達(dá)72 h 時(shí)，其存活率顯著下降且與48 h 時(shí)存在顯著性差異（P<0.05）；由圖4C 可知，隨著DNT-Se 與細(xì)胞共孵育的時(shí)間的增加，其存活率逐漸降低，對(duì)三個(gè)時(shí)間段的半數(shù)致死濃度進(jìn)行計(jì)算，DNT-Se 在24、48、72 h 的IC50分別為412.81、125.64、42.54 μg/mL?？梢?，DNT-Se 對(duì)HepG2 細(xì)胞的作用具有時(shí)間依賴性，且在各時(shí)間段內(nèi)，DNT-Se 組的IC50均低于Se NPs 組，可說明經(jīng)DNTs 分散后的制劑（DNT-Se）能使更多的Se NPs 進(jìn)入肝癌細(xì)胞，從而更好地發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖的作用?？紤]到制劑在體內(nèi)的代謝情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)擬采用48 h 作為DNT-Se 及各組樣品與細(xì)胞的作用時(shí)間。

圖4 DNTs、Se NPs、DNT-Se 與不同細(xì)胞在不同孵育時(shí)間的存活率Fig.4 Survival rates of different cells at different incubation time of DNTs, Se NPs and DNT-Se

為了進(jìn)一步考察DNT-Se 對(duì)正常細(xì)胞的影響，本研究采用293T 人胚胎腎細(xì)胞及AML-12 小鼠正常肝細(xì)胞的CCK8 實(shí)驗(yàn)以確證其安全性。如圖4D 所示，DNT-Se 分別與293T 細(xì)胞和AML-12 細(xì)胞作用48 h 后，即使在最高濃度（200 μg/mL）時(shí)，其細(xì)胞存活率仍高于82%，說明DNT-Se 對(duì)正常細(xì)胞并無毒性作用，具有良好的生物安全性。

3 結(jié)論

本文采用原位還原法制備黑木耳β-葡聚糖/納米硒復(fù)合物（DNT-Se），考察了DNTs 濃度、維生素C 與亞硒酸鈉配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、亞硒酸鈉濃度對(duì)DNT-Se 粒徑大小的影響，最終確定DNT-Se的最佳制備工藝為DNTs 濃度1.0 mg/mL，維生素C與亞硒酸鈉配比6:1，亞硒酸鈉濃度為1.0 mol/L，反應(yīng)溫度為25 ℃，反應(yīng)時(shí)間為12 h，所得DNT-Se粒徑平均值為34.50 nm。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNT-Se 對(duì)293T 人胚胎腎細(xì)胞及AML-12 小鼠正常肝細(xì)胞基本無毒性，但是對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且其對(duì)HepG2 肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于Se NPs。本研究為多糖/納米硒復(fù)合物的研究奠定了基礎(chǔ)。