崔文濤，鄒宇凡，白志毅,2*，王志炎，李典中

(1.上海海洋大學，農業(yè)農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；2.上海海洋大學，上海市水產養(yǎng)殖工程技術研究中心，上海 201306；3.蕪湖盛典休閑生態(tài)園有限公司，安徽 蕪湖 241200)

生物的遺傳多樣性主要體現(xiàn)在不同個體或群體間DNA 和蛋白質序列的遺傳距離和差異上，其不受時間的推移而增加，主要受限于功能和表觀遺傳的復雜性[1]。遺傳多樣性通常通過限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、隨機擴增多態(tài)DNA (RAPD)、微衛(wèi)星(SSR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)等分子標記來評估，微衛(wèi)星也稱為SSRs，是一種在真核生物基因組中具有高度變異的簡單重復DNA 序列[2]。由于其符合孟德爾的遺傳規(guī)律，具有高度多態(tài)，共顯性，且高度可復制，易于操作[3]等優(yōu)點，因此，通過SSR 獲得的遺傳多樣性數(shù)據(jù)可用于調查的物種遺傳變異性，且為防止物種的遺傳多樣性隨著時間推移而喪失提供了理論參考[4]。SSRs 也被廣泛應用于水產動物的遺傳連鎖圖譜構建、數(shù)量性狀基因座(QTL)作圖、群體遺傳分析、親子鑒定和分子標記輔助選擇(MAS)等[5-6]。

克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)俗稱淡水龍蝦，其具有適應性廣、繁殖力強、生長快、肉質鮮美及營養(yǎng)豐富等特點，廣受國內外養(yǎng)殖者和消費者青睞。克氏原螯蝦原產于美國東南部和墨西哥東北部[7]，后經(jīng)日本引入我國[8]，已在我國各地廣泛分布并形成了不同的地理種群。國外學者均已先后對其國內克氏原螯蝦的種群擴散過程、機制和種群遺傳結構的做了大量研究工作[9-11]。在國內，Yue 等[12]等利用微衛(wèi)星標記分析了6 個地區(qū)的克氏原螯蝦遺傳多樣性和種群結構。李艷和[13]對我國的35 個群體以及1 個美國種群、1 個日本種群進行群體遺傳多樣性和種群遺傳結構分析。邢智珺等[14]分析了江蘇8 個克氏原螯蝦群體遺傳多樣性和遺傳結構。上述研究結果表明，盡管我國克氏原螯蝦遺傳多樣性低于美國、日本群體，但整體遺傳多樣性水平較高。

克氏原螯蝦的稻蝦種養(yǎng)面積、水產品產量分別占全國稻漁綜合種養(yǎng)總量的47.70%和60.84%，為最大規(guī)模的稻漁綜合種養(yǎng)模式[15]。根據(jù)《中國小龍蝦產業(yè)發(fā)展報告(2020)》[16]，2019 年安徽地區(qū)的克氏原螯蝦產量達34.98 萬t，位居全國第二。隨著我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖規(guī)模擴大，成蝦規(guī)格、品質帶來的市場價格差距加劇了養(yǎng)殖業(yè)的競爭。而克氏原螯蝦養(yǎng)繁一體的養(yǎng)殖模式及捕大留小的苗種供給方式，不利于親本留種和良種選育，導致克氏原螯蝦種質的衰退及抗病力低等問題，嚴重制約著我國克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展[17]。目前對安徽地區(qū)克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性評估鮮有報道，因此有必要對安徽克氏原螯蝦養(yǎng)殖群體進行遺傳多樣性的評估。本研究利用10對微衛(wèi)星標記分子對安徽(3 個人工養(yǎng)殖群體和2個野生群體)、湖北(1 個人工養(yǎng)殖群體)和江蘇(3個人工養(yǎng)殖群體)共9 個克氏原螯蝦群體的遺傳結構進行分析，旨在了解安徽不同地區(qū)人工養(yǎng)殖的克氏原螯蝦群體間的遺傳差異，為生產養(yǎng)殖提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采樣和DNA 的提取

2020 年分別采集了蕪湖(WH)、宣城(XC)、合肥(HF)、監(jiān)利(JL)、建湖(JH)、滆湖(GH)、興化(XH) 7 個地區(qū)的稻漁綜合種養(yǎng)示范區(qū)人工養(yǎng)殖群體和銅陵(TL)、馬鞍山(MAS) 2 個地區(qū)的野生群體(圖1)，共270 尾克氏原螯蝦樣品用于實驗研究。將所有克氏原螯蝦的尾殼去除，露出白色肌肉，然后收集肌肉組織，并用無水乙醇固定，然后按照制造商的說明，使用海洋動物組織基因組試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行總DNA 提取，利用分光光度計測定其濃度和純度，并于-20 °C 低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。本研究獲得了上海海洋大學實驗動物管理和使用倫理委員會批準(SHOU-DW-2019-003)，實驗過程中操作人員嚴格遵守上海海洋大學倫理規(guī)范，并按照上海海洋大學倫理委員會制定的規(guī)章制度執(zhí)行；所有實驗均按照當?shù)氐难芯縿游锸褂脺蕜t進行，并經(jīng)倫理委員會批準。

圖1 9 個克氏原螯蝦群體采樣地點JL.監(jiān)利群體，JH.建湖群體，GH.滆湖群體，XH.興化群體，TL.銅陵群體，MAS.馬鞍山群體，WH.蕪湖群體，XC.宣城群體，HF.合肥群體；下同。Fig.1 Sampling sites of 9 P.clarkii populationsJL.Jianli populations,JH.Jianhu populations,GH.Gehu populations,XH.Xinghua populations,TL.Tongling populations,MAS.Maanshan populations,WH.Wuhu populations,XC.Xuancheng populations,HF.Hefei populations;the same below.

1.2 引物的合成

為了節(jié)約實驗成本，本研究參照了Schuelke[18]TP-M13-SSR 技術，把M13 正向引物的5′端帶上熒光標記(表1)，選用10 對已發(fā)表、擴增條件較好、多態(tài)性高的克氏原螯蝦SSR 引物[10,14,19]的反向引物和M13 引物相連作為M13-SSR 的正向引物，其正常的正向SSR 引物作為M13-SSR 的反向引物(表2)；M13-SSR 引物及5′端帶有熒光標記的M13 正向引物引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 5′端帶有熒光標記的M13 正向引物及序列Tab.1 The M13 forward primer fluorescent-labelled at 5′end

表2 克氏原螯蝦10 對微衛(wèi)星引物Tab.2 Primers of 10 microsatellites in P.clarkii

1.3 PCR 擴增與數(shù)據(jù)分析

PCR 反應分2 步進行。第1 步把SSR 反向引物與M13 的正向引物相連擴增為M13-SSR 引物，第2 步SSR 擴增產物的熒光標記，使用M1-SSR3引物與SSR 正向引物擴增獲得的PCR 產物與表1中M13 熒光引物再進行擴增，所采用的PCR 反應體系均經(jīng)過了優(yōu)化。在篩選引物時，先用PAGE 檢測引物的擴增效果，然后選取擴增效果理想的擴增產物交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行分型(圖2)。

采用軟件POPGEN 3.2 統(tǒng)計群體的遺傳多樣性參數(shù)；根據(jù)Botstein 公式[20]計算Hardy-Weinberg 遺傳偏離指數(shù)(D)[21]，采用Bonferroni 方法校正顯著性標準；群體遺傳分化指數(shù)(Fst)及基因流(Nm)利用軟件CERVUS 3.0 統(tǒng)計并進行分子方差分析(AMOVA)；Structure 2.3[22-23]等軟件對群體的遺傳結構進行統(tǒng)計和分析；基于遺傳距離用Mega 4.0 軟件構建UPGMA 系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 種群遺傳多樣性分析

10 對微衛(wèi)星引物擴增結果顯示，等位基因數(shù)(Na)為3～33 個(平均15.70 個)，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.50～13.89 (平均4.76 個)，觀測雜合度(Ho)為0.12～0.91，期望雜合度(He)為0.33～0.93；各群體的多態(tài)性信息含量(PIC)為0.31～0.92，除了PCL28 位點為中度多態(tài)性外，其他9 個位點均屬于高度多態(tài)性位點(PIC＞0.5) (表3)，可用于微衛(wèi)星遺傳結構分析。

表3 克氏原螯蝦15 個微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Statistics of number of effective alleles,expected and observed heterozygosity and polymorphism information content for microsatellite loci of P.clarkii

9 個克氏原螯蝦群體(270 尾)的遺傳多樣性如表4 所示，總體上，9 個群體均具有較高的遺傳多樣性。群體水平遺傳多樣性參數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，XC 群體在等位基因數(shù)(Na=7.70)、有效等位基因數(shù)(Ne=4.40)、觀測雜合度(Ho=0.50)、期望雜合度(He=0.74)和多態(tài)性信息含量(PIC=0.67)均最高，與其他群體間均存在顯著差異(P＞0.05)，而JL 群體的遺傳多樣性最低(PIC=0.48)，其群體的遺傳多樣性有待提高?？傮w上9 個群體均具有較高的遺傳多樣性，且安徽地區(qū)人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性普遍高于其他幾個群體。

表4 克氏原螯蝦9 個群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab.4 Summary statistics of genetic diversity of nine P.clarkii populations

利用Hardy-Weinberg 平衡對9 個群體中所有位點基因平衡狀態(tài)進行檢驗，9 個群體各位點平均遺傳偏離指數(shù)為-0.568～-0.178，經(jīng)邦弗朗尼校正，9 個群體的大多數(shù)位點均顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡(表5)，與其他群體相比，HF 群體的偏離程度最高，JL 和XH 群體的偏離程度最低。此外，人工養(yǎng)殖群體和野生群體均表現(xiàn)出雜合子缺失現(xiàn)象，由于其具有較強的繁殖力，親緣關系較近的后代極易發(fā)生近親繁殖，說明近親繁殖是群體間偏離Hardy-Weinberg 平衡的主要因素，為安徽地區(qū)克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖群體的遺傳改良提供參考。

表5 克氏原螯蝦9 個群體遺傳偏離指數(shù)(D)Tab.5 Deviation (D) assessed for the nine populations of P.clarkii

2.2 種群遺傳分化分析

克氏原螯蝦9 個群體基因流(Nm)及群體遺傳分化指數(shù)(Fst)顯示，各群體間基因流為1.028～10.299，不同群體之間存在著廣泛的基因交換，GH 和JH 群體間的基因交流最廣泛(Nm=10.299)。群體遺傳分化指數(shù)為0.024～0.196，其中除了XC群體的分化程度較低(Fst＜0.05)，HF 群體與其他群體的Fst均表現(xiàn)出高度分化(Fst＞0.15) (表6)。

表6 克氏原螯蝦9 個群體基因流(Nm，對角線上)和遺傳分化系數(shù)(Fst，對角線下)Tab.6 Gene flow (Nm，above diagonal) and genetic diversity (Fst，below diagonal) in nine P.clarkii populations

9 個克氏原螯蝦群體遺傳相似系數(shù)和遺傳距離結果顯示，各群體間遺傳相似系數(shù)(I)為0.078～0.939，遺傳距離(DA)為0.064～0.746；WH 群體與JH 群體的遺傳距離最小，遺傳相似度最大。而JH 群體與XH 群體的遺傳距離最大，遺傳相似度最小(表7)。AMOVA 分析結果表明，88.58%的遺傳變異來自群體內變異，而其余的(11.42%)來自群體間的變異，群體間遺傳分化達到極顯著水平(P＜0.01) (表8)。

表7 克氏原螯蝦9 個群體間遺傳相似系數(shù)(I，對角線上)及遺傳距離(DA，對角線下)Tab.7 Genetic similarity indices (I，above the diagonal) and genetic distances (DA，below the diagonal) among nine populations of P.clarkii

表8 安徽省克氏原螯蝦群體分子方差分析Tab.8 AMOVA analysis among P.clarkii populations in Anhui Province

基于Nei 氏遺傳距離對克氏原螯蝦9 個群體構建UPGMA 系統(tǒng)樹，結果顯示，9 個群體可分為5 組，即WH、GH、MAS 和JH 群體聚為一組，XC 和HF 群體同屬于一組，而TL、XH 及JL 群體分別自成一組(圖3)。

圖3 基于Nei 氏遺傳距離的UPGMA 聚類樹Fig.3 UPGMA clustering tree based on Nei’s genetic distance

2.3 種群遺傳結構分析

本研究根據(jù)K值對應參數(shù)的趨勢分析，發(fā)現(xiàn)K=5 時出現(xiàn)折點(圖4，圖5)，說明最有可能的亞種群數(shù)為5。圖5 給出了K=3、K=4 和K=5 的遺傳結構圖。在養(yǎng)殖群體中XC 和HF 2 個養(yǎng)殖群體的大多數(shù)個體被分配到相同的遺傳群的中，這表明它們具有較高的遺傳相似性；而其他養(yǎng)殖群體的一些個體較混雜。在野生群體中，TL 群體的個體遺傳結構相對單一，與其他群體的個體有明顯區(qū)別。

圖4 用Structure 獲得的平均可能性和ΔK 評估(利用Structure 軟件12 次重復計算ΔK 的平均值)Fig.4 Plot of mean likelihood values (averaged across 12 runs) and estimate of ΔK for each possible value of K using the data obtained from Structure software

圖5 克氏原螯蝦9 個群體所有個體的遺傳結構圖Fig.5 Output from the program Structure assuming (K=3),(K=4) and (K=5) nine populations of P.clarkii

3 討論

SSR 標記因具有多態(tài)性高、易操作及共顯性遺傳等特點，已被廣泛應用于水產動物種質資源和選擇育種等研究中[5-6]。本研究采用的10 對微衛(wèi)星位點的平均等位基因數(shù)(Na) 15.70 個，平均有效等位基因數(shù)(Ne) 4.76 個，與Yue 等[12]、Zhong 等[23]和邢智珺等[14]的結果相比均較高，具有高度多態(tài)性，但仍低于曹玲亮等[24]獲得的平均等位基因數(shù)，這與檢測技術和樣本收集的差異密切相關，即便使用相同的微衛(wèi)星位點，但在采用不同檢測技術進行分析時仍有可能表現(xiàn)出較大差異，通常認為先進的檢測技術是等位基因檢測的分辨率和準確性的有效保障[25]。多態(tài)性信息含量(PIC)為0.31～0.92，根據(jù)相關標準[26]，高度多態(tài)性位點的PIC大于0.50，而小于0.25 的為低度多態(tài)性位點，本研究中除了PCL28 位點為中度多態(tài)性外，其他均屬于高度多態(tài)性位點，均能用于各群體的遺傳多樣性分析。

克氏原螯蝦作為一種入侵物種，由于其具有較高的商業(yè)價值，已成為中國最重要的淡水水產資源之一[26]。研究者們通過采集我國不同地區(qū)種質的克氏原螯蝦群體來研究我國克氏原螯蝦的入侵路線，發(fā)現(xiàn)我國的克氏原螯蝦已具有較高的遺傳多樣性[12-14,24]。為了滿足消費者的需求，我國各地區(qū)開展了大量的克氏原螯蝦的人工飼養(yǎng)，由于不同的生長條件和管理差異，從而導致了不同種群之間不同的質量水平和遺傳多樣性。本研究中，9 個群體均具有較高的遺傳多樣性，其中，XC 群體的遺傳多樣性顯著高于大多數(shù)群體(P＞0.05)，可能與其受開發(fā)利用程度較低有關。而JL 群體的遺傳多樣性均顯著低于大多數(shù)群體，應與多代人工選擇造成較高種質純度有關，2 個人工養(yǎng)殖群體所表現(xiàn)出的遺傳多樣性水平差異，可能與其育種技術及育種的基礎群體相關。總體上，安徽人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均高于對照群體，與Zhong 等[23]和李艷和[13]報道的群體相比均保持了相對較高的遺傳多樣性。這可能是由于從各種種群中多次引入不同的個體和不同的養(yǎng)殖條件，產生了迅速的遺傳變異，使得種群具有較高的遺傳多樣性。Hardy-Weinberg 平衡表明，9 個群體均存在顯著的雜合子缺失，其中HF 群體表現(xiàn)更突出，類似于Yue 等[12]的發(fā)現(xiàn)，這可能是由于創(chuàng)始人效應和非隨機交配引起[27-28]，安徽作為我國克氏原螯蝦主要產區(qū)之一，其養(yǎng)殖群體應該存在大量的引種現(xiàn)象。由于克氏原螯蝦的繁殖能力較強，在人工養(yǎng)殖過程中極易造成親緣相近的克氏原螯蝦個體間發(fā)生交配，因此，有必要加強不同區(qū)域間的群體進行交配，以改善近親繁殖的現(xiàn)狀。

遺傳結構是判斷新物種適應新棲息地能力的主要因素[29]。根據(jù)AMOVA 結果顯示，變異主要發(fā)生在種群內(88.58%)，只有很小一部分發(fā)生在種群間，與邢智珺等[14]和Yi 等[30]的研究結果一致，人工養(yǎng)殖種群與野生種群的AMOVA 結果相同。大多數(shù)學者認為，不同群體具有不同的遺傳分化[30-31]，物種間的遺傳分化與基因交流密切相關[32]。本研究中，在安徽地區(qū)的人工養(yǎng)殖群體中，WH 與JH 群體間基因流水平最高(Nm=9.710)，遺傳分化指數(shù)最小(Fst=0.025)，說明2 群體間的基因交流較為廣泛(Nm＞4)，2 個群體間存在相互引種的可能。HF 與TL 群體間基因流水平最低(Nm=1.028)，遺傳分化指數(shù)最高(Fst=0.196)，說明2 群體間基因交流較為匱乏，群體間存在顯著遺傳分化(Fst＞0.15)，這可能是由于長期封閉養(yǎng)殖模式和人工引入造成的，因為本研究WH 和HF 群體是人工養(yǎng)殖群體，野生群體不能進入與之交配，造成類似自然地理隔離，降低了發(fā)生基因交流的可能性。因此，可以通過改善育種技術和降低捕撈強度來加強群體間的基因交流。

由于人類傳播、遺傳漂變和種群規(guī)模等多種因素的影響[12]，使得遺傳距離與地理距離相關性顯著降低。本研究中的JL 群體在地理上均遠離其他8 個群體，但克氏原螯蝦具有較高的商業(yè)價值，因此他們之間的遺傳距離不同可能是引種程度不同所造成的。9 個克氏原螯蝦群體基于Nei 氏遺傳距離構建的UPGMA 系統(tǒng)樹顯示，9 個群體可分為5 組，即JH、WU、GH 和MAS 群體聚為一組，XC 和HF 群體同屬于一組，而TL、XH 和JL 群體分別自成一組，與Structure 基于個體遺傳組成的群體模擬分析的研究結果相類似。結合對群體遺傳聚類及遺傳結構等分析可以發(fā)現(xiàn)，XC和HF 群體的大多數(shù)個體被分配到相同的遺傳群體中，這可能與它們引進了相同的基礎選育群體有關。而WH 與MAS 群體、JH 群體、GH 群體及XH 群體的一些個體相較混雜，極有可能是它們之間相互引種所導致的。在野生群體中，TL 群體的個體遺傳結構相對單一，與其他群體的個體有著明顯的區(qū)別，說明TL 群體的開發(fā)利用程度較低。相對自然選擇，位點等位基因頻率與人工干預程度有著重要的影響，而且位點等位基因頻率改變和群體遺傳結構純化與人工選擇過程的相關性更明顯。

總之，通過對這9 個群體的遺傳多樣性和遺傳機構分析，可以看出安徽地區(qū)的人工養(yǎng)殖群體具有較高的遺傳多樣性，其中XC 群體的遺傳多樣性最高，遺傳結構也較為合理，可以作為人工引種的基礎選育群體。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）