李 榮, 高曉雨, 王 鑫, 馬 媛, 閻 穎

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 陜西 西安 710038)

宮頸高危人乳頭瘤病毒(HPV)感染為常見的婦科疾病,當(dāng)前臨床發(fā)現(xiàn)超過200種HPV亞型,其中40多種會導(dǎo)致生殖系統(tǒng)感染。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,HPV陽性占比率高達(dá)15%～30%,且患者病情發(fā)展較快,尤其是高危型HPV感染者在較短時間內(nèi)可能發(fā)展為宮頸鱗癌(SCC)[1-2]。常見的高危型包括HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59及68等亞型,其中由HPV16、18引起的宮頸癌占比在80%左右[3]。HPV亞臨床表現(xiàn)(SPI)患者常表現(xiàn)為一過性感染,可自行消退,且90%HPV患者在感染2年內(nèi)可自我清除,另外1%的患者可能發(fā)展為惡性腫瘤,提示自身免疫系統(tǒng)在抗HPV感染中具有重要作用[4]。機(jī)體外周免疫主要包含體液、細(xì)胞與固有免疫組成,體液免疫主要經(jīng)B淋巴細(xì)胞介導(dǎo),在B細(xì)胞內(nèi),免疫球蛋白基因可重排產(chǎn)生大量抗體,發(fā)揮對異己的排斥作用,從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[5]。針對機(jī)體內(nèi)細(xì)胞免疫過程則主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo),使得亞群中CD4+促進(jìn)B淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖、分化,從而對體液免疫產(chǎn)生抑制作用;抗原提呈細(xì)胞會刺激CD8+對靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷,發(fā)揮清除異常細(xì)胞作用。固有免疫主要經(jīng)自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞介導(dǎo),經(jīng)吞噬作用對病原體產(chǎn)生殺傷,發(fā)揮免疫作用。高危型HPV持續(xù)感染后可能發(fā)展為宮頸癌,SCC為主要病理分型。本研究探討宮頸高危HPV感染不孕癥患者不同亞型與不同宮頸病變分級的T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞及NK細(xì)胞水平變化情況,旨在為臨床診斷、治療及預(yù)后評估提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性收集2019年11月至2020年10月我院婦科就診的1150例宮頸高危HPV感染不孕癥和580例HPV陰性的不孕癥患者臨床資料,分別納入研究組、對照組,兩組一般資料對比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,有可比性(P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料的比較

1.2納排標(biāo)準(zhǔn):納入標(biāo)準(zhǔn):①均已婚,且性生活正常、未避孕,同居一年以上均未孕者;②采樣時處于非經(jīng)期;③研究組液基薄層細(xì)胞制片檢查存在輕度宮頸炎;④研究組高危型人HPV檢查中主要表現(xiàn)為HPV16及HPV18,其他12種高風(fēng)險亞型,對照組檢查為人HPV陰性;⑤臨床資料詳實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn):①男方因素所致不孕;②既往有子宮切除或?qū)m頸手術(shù)、卵巢手術(shù)史;③近1年使用免疫抑制劑治療;④存在其他病毒感染或感染性疾病;⑤存在重要臟器器質(zhì)性病變者;⑥處于生殖道急性感染期;⑦半年內(nèi)有重大手術(shù)、創(chuàng)傷刺激者。

1.3方 法

1.3.1標(biāo)本采集:①采集宮頸細(xì)胞:使用專用棉簽于患者宮頸處旋轉(zhuǎn)5～6周,使盡可能多的細(xì)胞被采集,密閉待檢。②采集淋巴細(xì)胞亞群:抽取患者靜脈血,置于抗凝管中,混勻,送檢。

1.3.2試劑及儀器:試劑:異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD3抗體、別藻藍(lán)蛋百(APC)標(biāo)記的CD4抗體、藻紅素(PE)標(biāo)記的CD8抗體、PE標(biāo)記的CD16+56+抗體、APC標(biāo)記的CD19抗體、溶血素(10倍濃縮)均購自美國BD公司。儀器:美國BD公司提供,型號為FACS CantoⅡ型流式細(xì)胞儀;上海宏石醫(yī)療科技有限公司提供的熒光定量PCR擴(kuò)增儀(型號為SLAN-96P);羅氏全自動核酸提取儀(型號為cobas4800)。

1.3.3檢測方法:①HPV分型檢測:采用全自動核酸提取儀及PCR分析系統(tǒng)檢測HPV核酸及分型。②T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的檢測:取抗凝血放置在離心管后,添加熒光標(biāo)記抗體(FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8、PE-CD16CD56、APC-CD19)各5μL,將抗體輕柔注入后放置于室溫、避光環(huán)境中等待20min,使特異分子被完全標(biāo)記。配制紅細(xì)胞裂解液(每只離心管中裂解液量為2mL,計算稀釋后裂解液總量,比例1∶10)。標(biāo)記充分后加入適量裂解液,同時給予高速震蕩,促進(jìn)紅細(xì)胞裂解,完成后將各支離心管避光室溫靜置10min,充分裂解后加1mL磷酸鹽緩沖液,進(jìn)行離心處理,2000r/min,離心時間為5min,完成后棄上清液,并將管壁上液體盡量吸干,再加入300μL磷酸鹽緩沖液,轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測。

1.3.4宮頸病變分級:將宮頸高危型HPV感染者HPV-DNA檢測陽性,無體征及臨床癥狀者納入亞臨床感染(SPI)組,將存在宮頸病變且依據(jù)宮頸多點(diǎn)活檢結(jié)果判定為鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)組、宮頸鱗癌(SCC)組,其中SIL包含低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)亞組和高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)亞組。

2 結(jié) 果

2.1兩組T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞水平比較:兩組CD3+、B細(xì)胞比例比較無顯著差異(P>0.05),研究組CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞比例低于對照組,CD8+高于對照組(P<0.05),見表2。

表2 兩組T淋巴細(xì)胞亞群B細(xì)胞NK細(xì)胞水平比較

2.2HPV亞型占比分析:不同分型HPV感染者HPV 16/18占比情況比較有顯著差異(χ2=19.681,P<0.05),且隨著疾病發(fā)展,HPV 16/18占比依次升高,見表3。

表3 HPV 亞型占比分析n(%)

2.3不同宮頸高危HPV感染不孕癥亞型患者T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞水平比較:HPV高危感染者中HPV 16/18亞型占比54.78%高于其他亞型感染者,且HPV 16/18亞型HPV感染者CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞比例低于其他亞型HPV感染者,CD8+高于其他亞型HPV感染者(P<0.05),但不同亞型HPV感染者CD3+、B細(xì)胞比例比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表4。

表4 不同宮頸高危HPV感染不孕癥亞型患者T淋巴細(xì)胞亞群B細(xì)胞NK細(xì)胞水平比較

2.4不同病變級別宮頸高危HPV感染不孕癥患者T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞水平比較:隨著宮頸病變分級,CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞比例依次降低,CD8+細(xì)胞比例依次升高(P<0.05),CD3+、B細(xì)胞比例無明顯變化(P>0.05),見表5。

表5 不同病變級別宮頸高危HPV感染不孕癥患者T淋巴細(xì)胞亞群B細(xì)胞NK細(xì)胞水平比較

3 討 論

當(dāng)前生殖道感染及免疫功能異常是導(dǎo)致女性不孕癥的主要危險因素[6]。性傳播感染可經(jīng)生殖道沿線不同組織改變其功能,進(jìn)一步降低生育功能,誘發(fā)不孕。HPV為性傳播感染病毒,高危型HPV感染者生殖道極易出現(xiàn)真菌、衣原體、支原體以及多種病毒合并感染,易誘發(fā)輸卵管受損、炎癥及瘢痕改變,誘發(fā)輸卵管性不孕發(fā)生,另外女性免疫功能異常后,亦會產(chǎn)生精子抗體,影響受孕[7]。人體在感染HPV后會產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)清除感染病毒,T林巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及B細(xì)胞改變均是影響細(xì)胞免疫的重要成分。

有學(xué)者提出,性行為、月經(jīng)、分娩、吸煙、口服避孕藥時間在8年以上、伴有免疫缺陷抑制等因素均會使宮頸癌發(fā)病率上升[8]。機(jī)體中維持正常的免疫功能依賴T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞平衡。CD4+、CD4+/CD8+、CD3+為常見T淋巴細(xì)胞亞群評估標(biāo)志物,B細(xì)胞為評估機(jī)體體液免疫有效指標(biāo),CD19+為其評估標(biāo)志物;NK細(xì)胞為機(jī)體中獨(dú)立淋巴細(xì)胞群,且NK細(xì)胞無需先致敏,無需激活抗體及補(bǔ)體則可發(fā)揮直接殺傷作用,其作用機(jī)制與T淋巴細(xì)胞亞群相似[9]。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸高危HPV感染不孕癥患者CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞比例低于HPV檢測陰性的不孕癥患者,CD8+更高,提示在出現(xiàn)宮頸高危HPV感染后,機(jī)體則會處于免疫抑制狀態(tài),NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群可作為評估宮頸高危HPV感染的獨(dú)立有效因素。近年來有研究提出,HPV感染會在一定程度上誘發(fā)宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌,因此建議臨床盡早檢測HPV感染分型,篩查高危HPV感染,這對于改善患者預(yù)后水平十分關(guān)鍵。本研究中發(fā)現(xiàn)HPV高危感染者中HPV 16/18亞型占比54.78%高于其他亞型感染者,且HPV 16/18亞型HPV感染者CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞比例低于其他亞型HPV感染者,CD8+高于其他亞型HPV感染者,但不同亞型HPV感染者CD3+、B細(xì)胞比例比較無顯著差異,提示高危HPV感染主要類型為HPV 16/18,且HPV 16/18亦可能是導(dǎo)致宮頸癌前病變、宮頸癌的主要因素;但與體液免疫相關(guān)的B細(xì)胞在不同HPV感染亞型中無明顯變化。

輔助性T細(xì)胞包含Th1、Th2,前者參與機(jī)體細(xì)胞免疫,CD8+細(xì)胞為主要執(zhí)行因子;后者則能促進(jìn)B細(xì)胞分化,誘導(dǎo)抗體分泌細(xì)胞生成,進(jìn)而參與機(jī)體體液免疫,其中CD4+為主要執(zhí)行因子。相關(guān)文獻(xiàn)報道,機(jī)體抗HPV感染過程中Th細(xì)胞至關(guān)重要,其中Th1/Th2穩(wěn)定是保障免疫功能的基礎(chǔ)[10]。NK細(xì)胞是構(gòu)成人體防御系統(tǒng)的重要部分,亦為免疫防線,能發(fā)揮較好的抗腫瘤免疫作用。本研究結(jié)果顯示,隨宮頸病變分級進(jìn)展,CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞比例逐漸降低,CD8+細(xì)胞比例升高,CD3+、B細(xì)胞比例無明顯變化,提示機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài),主要原因在于隨高危型HPV感染患者病情嚴(yán)重程度的增加,患者體內(nèi)免疫平衡逐漸被消除,Th2細(xì)胞應(yīng)答明顯增強(qiáng),對細(xì)胞免疫產(chǎn)生抑制,進(jìn)一步降低CD4+細(xì)胞因子分泌水平,CD8+升高,促進(jìn)HPV感染進(jìn)展,機(jī)體則會對病毒產(chǎn)生耐受作用,出現(xiàn)免疫抑制狀態(tài);同時NK細(xì)胞能與腫瘤細(xì)胞相結(jié)合,并生成顆粒酶及穿孔素,進(jìn)而對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷,且不對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒作用,因此在抵抗腫瘤時機(jī)體會消耗大量NK細(xì)胞,使其比例明顯降低。

綜上所述,針對宮頸高危HPV感染不孕癥患者,建議臨床檢測其T淋巴細(xì)胞亞群、B細(xì)胞及NK細(xì)胞比例,了解感染亞型分型情況以及從SPI狀態(tài)逐漸發(fā)展至SIL病變進(jìn)展中機(jī)體免疫功能的變化狀態(tài),能為宮頸高危HPV感染不孕癥者早期免疫干預(yù)及預(yù)后提供有效依據(jù),但機(jī)體免疫功能與不孕癥之間的關(guān)系仍需擴(kuò)大病例繼續(xù)研究。