何耀海

(廣西省防城港市第一人民醫(yī)院病理科, 廣西 防城港 538021)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)即大腸癌,包括結(jié)腸癌與直腸癌,全球范圍內(nèi),結(jié)直腸癌是第三位最常見的惡性腫瘤,也是第二位最常見的惡性腫瘤死亡原因,而隨著居民飲食習慣改變,我國結(jié)直腸癌發(fā)病率也逐年升高[1]。結(jié)直腸癌根治術(shù)為治療CRC主要方式,但術(shù)后存在復發(fā)轉(zhuǎn)移情況使得患者總體預后仍不能令人滿意。富含亮氨酸重復單位的G蛋白耦聯(lián)受體5(Leucine-rich G-protein-coupled receptor 5,LGR5)系一種糖蛋白激素受體,與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2]。人表皮生長因子受體2(Human epidermogenic factor receptor 2,Her-2)是一種表皮生長因子,在多種惡性腫瘤中均有表達,可促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲[3]。Ki-67為常用細胞增殖抗原,同時也為腫瘤標志物之一。本研究擬通過分析LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中表達,觀察其和臨床病理參數(shù)的關(guān)系,并探討三者對患者預后的預測價值,報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2020年1月至2021年7月防城港市第一人民醫(yī)院收治的132例結(jié)直腸癌患者臨床資料。男75例,女57例,年齡為45～76歲,平均(60.50±5.70)歲。納入標準:①符合文獻[4]中關(guān)于原發(fā)性CRC的診斷標準,且經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為腺癌;②術(shù)前未接受放、化療治療;③均行結(jié)直腸癌根治術(shù)。排除標準:①合并除CRC外的其他惡性腫瘤;②合并嚴重肝腎功能障礙;③合并自身免疫病;④合并嚴重感染性疾病;⑤臨床資料不完整。

1.2方 法

1.2.1臨床病理參數(shù)收集:收集性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移情況等臨床病理參數(shù)。

1.2.2標本采集:患者入院后均接受結(jié)直腸癌根治術(shù)治療,術(shù)后留存新鮮(離體30min內(nèi))癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5cm)標本,置于EP管內(nèi),液氮冷凍并于-80℃下冷藏待測。

1.2.3主要試劑:鼠抗人LGR5單克隆抗體、鼠抗人Her-2單克隆抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體、免疫組化SP-9000試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10%山羊血清封閉液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2.4免疫組織化學檢測:采用免疫組化SP法檢測LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達水平。①取組織石蠟包塊,常規(guī)切片(LGR5為3μm,Her-2為4μm,Ki-67為5μm)、脫蠟處理;②高壓修復抗原;③阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶;④滴加羊血清封閉;⑤滴加采用PBS稀釋(LGR5稀釋比為1∶300,Her-2稀釋比為1∶100,Ki-67稀釋比為1∶400)鼠抗人一抗,PBS沖洗;⑥滴加經(jīng)辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗;⑦滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶(SP);⑧DAB顯色;⑨蘇木素復染;⑩脫水、透明、封片、鏡檢。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.5結(jié)果判讀:結(jié)果由2位資深病理醫(yī)師雙盲法單獨閱片,于高倍鏡下(×400倍)隨機挑選5個視野,每個視野選取100個細胞。LGR5在細胞漿和細胞膜中呈黃色、棕黃色顆粒即視為陽性表達,Her-2在胞膜中呈棕黃色顆粒即視為陽性表達,Ki-67在細胞核中呈黃色、棕黃色顆粒即視為陽性表達。LGR5采用染色強度與陽性細胞占比乘積進行半定量分析:染色強度:無染色計0分,淺黃色計1分、黃色計2分,棕黃色計3分;陽性細胞占比:≤5%計0分,6%～25%計1分,26%～50%計2分,51%～75%計3分,>75%計4分,乘積得分0～4分為陰性表達,5～12分為陽性表達。Her-2參考文獻[5]標準判定:無染色或<10%細胞膜染色為陰性(-),>10%細胞膜不完整染色為(+),>10%細胞膜完整較弱染色為(++),>30%細胞膜完整較強染色為(+++),(-)納入陰性表達組,(+)、(++)、(+++)納入陽性表達組。Ki-67采用陽性細胞占比進行半定量分析:≤10%為(-),11%～25%為(+),26%～50%為(++),>50%為(+++),(-)納入陰性表達組,(+)、(++)、(+++)納入陽性表達組。

1.3隨訪及預后分組:術(shù)后隨訪12個月(電話或回院復查形式隨訪),獲悉患者預后,并根據(jù)預后情況分為預后良好組(114例)、預后不良組(18例)。預后良好:截止至隨訪結(jié)束生存,且未復發(fā)轉(zhuǎn)移;預后不良:截止至隨訪結(jié)束任何原因所致死亡,或出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移。

1.4統(tǒng)計學方法:數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件處理。計數(shù)資料以n(%)表示,行χ2/Fisher確切概率分析法檢驗;采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)評估預測價值,曲線下面積(AUC)0.7～0.9時有一定準確性,AUC>0.9時準確性較高。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1LGR5、Her-2、Ki-67蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中陽性表達情況比較:CRC組織中LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表1。

表1 LGR5 Her-2 Ki-67蛋白在CRC組織和癌旁正常組織中陽性表達情況比較n(%)

2.2LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達與CRC患者臨床病理參數(shù)關(guān)系:LGR5、Her-2、Ki-67蛋白表達與CRC患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度等無關(guān)(P>0.05)。LGR5、Ki-67蛋白表達與浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05);Her-2蛋白表達與浸潤程度無關(guān)(P>0.05),而與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 LGR5 Her-2 Ki-67蛋白表達與CRC患者臨床病理參數(shù)關(guān)系n(%)

2.3不同預后患者LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達情況比較:預后不良組患者LGR5、Her-2、Ki-67蛋白陽性表達率均高于預后良好組患者(P<0.05)。見表3。

表3 不同預后患者LGR5 Her-2 Ki-67蛋白陽性表達情況比較n(%)

2.4LGR5、Her-2、Ki-67蛋白對CRC患者預后的預測價值分析:以CRC患者預后為因變量(1=預后良好組,2=預后不良組),將LGR5、Her-2、Ki-67蛋白(1=陽性,2=陰性)納入Logistic回歸分析模型,結(jié)果見表4?？梢奓GR5、Her-2蛋白陽性表達是預測CRC患者預后的獨立預測因子(P<0.05)。Ki-67蛋白不是預測CRC患者預后的獨立預測因子(P>0.05)。經(jīng)計算可得,LGR5蛋白陽性表達預測CRC患者預后敏感度、特異度分別為66.7%、43.0%,Her-2蛋白為72.2%、72.8%。通過公式兩項聯(lián)合的預測指數(shù)=LGR5蛋白+(1.869/2.523)*Her-2蛋白繪制ROC曲線。結(jié)果顯示,兩項聯(lián)合預測AUC為0.804(0.709～0.899),敏感度、特異度為94.4%、82.5%,均高于LGR5、Her-2蛋白單項檢測,表明兩項聯(lián)合檢測的預測價值較高。見圖1。

圖1 兩項聯(lián)合預測CRC患者預后的ROC曲線

3 討 論

CRC為高度生物學異質(zhì)性惡性腫瘤之一,術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移率較高。探尋新型分子標志物對CRC診斷、病情評估、治療方法選擇以及預測預后意義重大。本研究通過免疫組化法檢測LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中表達水平與臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系,探討其是否可作為CRC病情評估及預后的新型分子標志物。

LGR5為一種胃腸道腫瘤標志物,有研究指出,LGR5陽性細胞具備極強的自我增殖、分化、更新能力,在CRC發(fā)生發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。陳懇等[6]研究顯示,LGR5在人CRC癌前病變中表達異常升高,推測CRC可能由LGR5陽性細胞發(fā)展而來。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中LGR5蛋白陽性表達率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),LGR5蛋白表達與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無關(guān),但和浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),說明LGR5蛋白可能在CRC腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列過程中扮演關(guān)鍵角色。分析原因為:LGR5蛋白通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進CRC發(fā)生發(fā)展,還可通過抑制Slug、N-cadherin等細胞黏附分子表達,促進上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化,從而增強腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

Her-2系迄今為止研究最多的乳腺癌相關(guān)基因,其過表達不但和腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān),而且還是一個重要的臨床治療監(jiān)測及預后指標[7]。國內(nèi)外關(guān)于Her-2蛋白在CRC組織中表達情況報道差異較大,其陽性表達率為1.6%～81.9%不等[8-9]。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中Her-2蛋白陽性表達率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),Her-2蛋白表達與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、浸潤程度無關(guān),但和TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān),說明Her-2蛋白可能參與了CRC腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程?？紤]原因為:Her-2蛋白可通過促進腫瘤組織形成新生血管及抑制腫瘤細胞凋亡,從而增強腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

Ki-67為一種目前廣泛使用的細胞增殖抗原,已有研究表明,其表達水平和腫瘤細胞生物學特性及患者預后有關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中Ki-67蛋白陽性表達率較癌旁正常組織高,分析其與臨床病理參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn),Ki-67蛋白表達與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度無關(guān),但和浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān),說明Ki-67蛋白可能參與了CRC腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程。究其原因為:Ki-67蛋白可通過減弱同質(zhì)性細胞間的黏附力以及重塑細胞外基質(zhì)來促進腫瘤組織新生血管形成,從而增強腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力。

此外,本研究結(jié)果顯示,LGR5、Her-2單獨檢測對CRC患者預后預測價值較低,而當兩項聯(lián)合檢測時,AUC、敏感度、特異度均明顯提高,表明兩項聯(lián)合檢測的預測價值較高。

綜上所述,LGR5、Her-2、Ki-67在CRC組織中呈高表達,其表達水平和患者臨床病理參數(shù)密切相關(guān),LGR5、Her-2兩項聯(lián)合檢測對患者預后具有較高預測價值。