亞森江·買買提, 郭自同, 買迪娜依·斯熱吉丁, 余小林, 劉小方, 程 慧

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊 830001)

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一種心肌特異性微血管并發(fā)癥,由心臟組織中對胰島素代謝作用的抵抗(例如胰島素抵抗)、代償性高胰島素血癥和高血糖共同促進產生[1]。目前,雖然有治療DCM的治療策略,但國內外的治療主要為控制血糖和血脂,缺乏針對受損心肌組織的有效藥物或策略[2]。因此,了解臨床癥狀,識別早期和高敏感性的診斷生物標志物,闡明潛在的致病機制,以及開發(fā)新的DCM靶向干預措施,對于改善患者的預后和預防疾病的發(fā)生和發(fā)展至關重要。在正常條件下,心肌細胞的自噬可以通過降解并回收細胞內廢物和受損細胞器來維持心肌細胞能量穩(wěn)態(tài)。然而自噬受損會導致心臟功能障礙,引發(fā)心力衰竭[3]。外泌體中包含microRNA和mRNA,是一種重要的生物基因傳遞系統(tǒng),可由多種類型的細胞分泌產生,包括免疫細胞(B 細胞、T 細胞、肥大細胞、樹突細胞)、神經元細胞、上皮細胞、內皮細胞、胚胎細胞、癌細胞和間充質干細胞等[4]。其中,骨髓間充質干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)來源的外泌體(簡稱BMSC-Exos)具有修復受損組織、較低免疫原性以及易于儲存和運輸等優(yōu)點,在治療DCM等糖代謝異常疾病中廣泛的應用。miR-122a是在肝臟中表達的miRNA,參與膽固醇和脂肪酸代謝。據報道,miR-122a的過表達顯著提高細胞保護性自噬水平,上調自噬標記物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的表達[5],然而,miR-122a是否可以通過激活心肌細胞自噬治療DCM仍不清楚,間充質干細胞來源的外泌體是否可以遞送miR-122a發(fā)揮作用仍需進一步研究。在本實驗中,通過將miR-122a轉染至小鼠BMSC-Exos中,并用于治療高脂高糖飲食聯合STZ誘導DCM 模型小鼠,觀察其對DCM小鼠的治療作用,并評估心肌細胞自噬水平,旨在為DCM的臨床藥物開發(fā)提供一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物:30只C57/B6小鼠均購自北京唯尚立德生物科技有限公司,實驗動物生產許可證號 SCXK(京)2021-0010,SPF級,體質量18g～20g,共計30只。所有小鼠均飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動物房內,自由進食飲水,保持動物房室內溫度21～25℃,12h晝夜溫控。適應性喂養(yǎng)7d后進行實驗。

1.2主要試劑和儀器:鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ;貨號:S0130)購自美國Sigma公司;α-MEM培養(yǎng)基(貨號:MEL08)、DMEM低糖完全培養(yǎng)基(貨號:MBS2567505)購自武漢艾美捷科技有限公司;胎牛血清(貨號:164210)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;0.25% 胰酶消化液(貨號:C0201)、RIPA裂解液(貨號:P0013B)和BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號:P0009)購自上海碧云天生物技術有限公司;Exosome Purification Column 外泌體純化柱(貨號:41212ES);Lipofectamine 2000(貨號:11668-027)、miR-122a模擬物和miR-NC質粒均購自美國Invitrogen;CD63(貨號:ab1318)、CD81(貨號:ab219209)、LC3Ⅱ(貨號:ab232940)、LC3Ⅰ(貨號:ab128025)、Beclin1(貨號:ab302669)、γH2AX(貨號:ab81299)、內參GAPDH(貨號:ab8245)以及HRP標記的二抗(貨號:ab6721)購自美國abcam;ECL化學檢測液(貨號:PE0010)購自北京索萊寶科技有限公司;ROS(貨號:ml092661)、IL-1β(貨號:ml028595)、IL-6(貨號:ml063159)和TNF-α(貨號:ml002095)的ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。TRIzol試劑(貨號:R0016)、逆轉錄試劑盒(貨號:AORT-0020)購自美國GeneCopoeia;全數字彩色多普勒超聲診斷儀(DW‐PE582)購自大為醫(yī)療(江蘇)有限公司;Bio-Rad ChemDoc高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(貨號:ChemiDoc)購自美國Bio-Rad。

1.3實驗方法

1.3.1BMSC的分離、培養(yǎng)及鑒定:小鼠經異氟醚吸入麻醉后脫頸處死,分離其完整的后肢,浸入75%酒精中消毒,無菌下剔除黏附于股骨和脛骨的軟組織,暴露出骨髓腔,使用α-MEM培養(yǎng)基反復沖洗髓腔,收集沖洗液,使用細胞篩網以去除其他組織,1200g室溫離心5min,棄上清,保留沉淀,用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸細胞,轉到培養(yǎng)皿中,在溫度37℃,含有5% CO2恒溫細胞孵育箱培養(yǎng),待細胞融合度達80%～90%,用0.25%胰酶消化細胞進行細胞傳代,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)較為均勻,培養(yǎng)5d后,細胞呈紡錘形,且螺旋狀排列。在培養(yǎng)10d時觀察到細胞數目明顯增多,分布均勻,紡錘形明顯。取第4代BMSC用于后續(xù)實驗。

1.3.2細胞轉染:取第4代BMSC,將細胞分為miR-122a和miR-NC組,調整細胞濃度為1×106/mL,接種于10cm的細胞培養(yǎng)皿,37℃、體積分數為5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h,觀察細胞80%融合后開始轉染,嚴格按照說明書采用Lipofectamine 2000將miR-122a和miR-NC轉染至BMSC細胞中。將轉染后的細胞在37℃,體積分數為5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4～6h后,加入8mL含體積分數為10%無外泌體血清的DMEM低糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)并拍照,分別收取上清液及細胞樣本進行后續(xù)實驗。

1.3.3外泌體提取及鑒定:將轉染后細胞培養(yǎng)上清液以5000g離心10min去除細胞碎片,3000g離心10min以去除死細胞,4℃以12000g離心60min,棄上清,用PBS均勻吹打,4℃以15000g離心2min,保留上清液,該上清液中富含外泌體顆粒。將收獲的外泌體顆粒粗品轉入Exosome Purification Filter(EPF)柱上室中,于4℃以5000g離心10min,離心后收集純化后的外泌體顆粒,電鏡顯微鏡觀察外泌體形態(tài),并使用Western blot檢測其CD63、CD81的表達,步驟參考1.3.4。

1.3.4Western blot檢測蛋白表達:加入RIPA裂解液提取心肌組織樣品,BCA法測定上清液中蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液,沸水浴煮沸10min。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒說明將蛋白樣品加至膠孔中,電泳100min后利用濕轉法進行轉膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1h,加入一抗CD63(1∶1000)、CD81(1∶1000)、LC3Ⅱ(1∶1000)、LC3Ⅰ(1∶1000)、Beclin1(1∶1000)、γH2AX(1∶1000)以及內參GAPDH(1∶2000),4℃孵育過夜。緩沖液清洗一抗,加入HRP標記的二抗(1∶5000),室溫孵育二抗2h,再次洗滌。ECL化學檢測液浸潤PVDF膜1min,置于化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。

1.3.5DCM模型的建立與分組給藥:將30只C57/B6小鼠平均分為3組:對照組、miR-122a組和miR-NC組,每組10只。參考文獻誘導DCM模型。miR-122a組和miR-NC組給予高脂高糖飲食飼養(yǎng),分別于第5、6周時經腹腔注射STZ(80mg/kg),對照組腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液,每周檢測血糖和體重變化。分別于第7、8周,miR-NC組尾靜脈注射BMSC-Exos-miR-NC(200μg/kg),miR-122a組尾靜脈注射BMSC-Exos-miR-122a(200μg/kg)進行治療,實驗第12周時處死小鼠。

1.3.6檢測各組小鼠心功能指標:實驗第12周時,將小鼠以3%水合氯醛麻醉,左側臥位,采用全數字彩色多普勒超聲診斷儀DW‐PE582檢測舒張末期室間隔厚度(IVSd)、左舒張末期后壁厚度(PWd)、左室短軸縮短率(LVFS)、每搏輸出量(SV)、心排出量(CO)、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮末期內徑(LVDs)和左室質量(LVM)。

1.3.7HE檢測心肌組織病理水平:收集小鼠心肌組織并用4%多聚甲醛固定過夜,然后進行10% EDTA脫鈣、石蠟包埋和切片(切割約5μm)。使用不同純度乙醇對5μm切片進行脫蠟和再水化,然后用蘇木精和伊紅染色。切片經乙醇脫水,再經二甲苯透明10min。將已透明的切片滴上樹膠,蓋上蓋玻片封固,顯微鏡下觀察心臟病理結構。

1.3.8ELISA檢測心肌組織ROS、IL-1β、IL-6和TNF-α水平:利用ELISA試劑盒標準流程,嚴格按照說明書檢測心肌組織上清液中ROS、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。根據標準品濃度對應吸光度制作標準曲線,并根據樣品吸光度計算樣品相應濃度。

1.3.9qRT-PCR檢測基因的表達水平:使用Trizol試劑提取細胞中的總RNA,酶標儀檢測RNA濃度和純度,按照逆轉錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒實驗說明,依次進行逆轉錄和qRT-PCR實驗。qRT-PCR反體系:cDNA模板2ng,上下游引物各0.4μL,SYBR Primix Ex TaqTM 5μL,ddH2O補充至10μL。qRT-PCR反應條件:95℃(30s)預變性后,變性95℃(7s),退火55℃(30s),72℃(15s),40個循環(huán)周期。擴增結果根據2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物序列:CAPDH-F,5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3,CAPDH-R,5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3;miR-122a-F,5-GCTGTGGAGTGTGACAATGG-3,miR-122a-R,5-GCCTAGCAGTAGCTATTTAGTGT-3。

2 結 果

2.1過表達miR-122a BMSC構建:qRT-PCR結果顯示,與BMSC-miR-NC(1.09±0.19)比較,BMSC-miR-122a(13.36±2.32)中miR-122a表達升高(t=10.02,P=0.012),見圖1。說明過表達miR-122a的BMSC構建成功。

圖1 三組細胞中miR-122a表達

2.2攜帶miR-122a BMSC-Exos鑒定:電鏡顯微鏡觀察顯示,外泌體呈現圓形顆粒狀形態(tài),粒徑集中在100nm附近,見圖2A。Western blot結果顯示,與BMSC細胞比較,BMSC-Exos-miR-NC和BMSC-Exos-miR-122a中CD63和CD81蛋白表達升高,見圖2B。此外,與BMSC-Exos-miR-NC(1.00±0.05)比較,BMSC-Exos-miR-122a(7.42±1.67)中miR-122a表達升高(t=6.78,P=0.023),見圖2C。

圖2 攜帶miR-122a的外泌體鑒定

2.3攜帶miR-122a BMSC-Exos改善DCM心功能指標:各組小鼠心功能檢測結果顯示,與對照組(0.57±0.10)(0.59±0.06)(27.68±1.04)(28.33±1.67)(12.33±0.99)(3.01±0.44)(2.08±0.13)(47.33±2.67)比較,miR-NC組小鼠IVSd(0.42±0.08)(t=6.98,P=0.026)、PWd(0.41±0.09)(t=6.13,P=0.033)、LVFS(21.99±1.65)(t=7.28,P=0.018)、SV(21.37±1.42)(t=6.97,P=0.022)、CO(9.34±0.88)(t=3.90,P=0.045)顯著降低,LVDd(3.50±0.17)(t=5.47,P=0.038)、LVDs(2.84±0.19)(t=6.53,P=0.030)、LVM(58.89±2.34)(t=7.65,P=0.017)顯著升高。與miR-NC組比較,miR-122a組IVSd(0.53±0.07)(t=10.88,P=0.011)、PWd(0.54±0.05)(t=4.41,P=0.042)、LVFS(27.11±1.89)(t=6.60,P=0.029)、SV(26.99±2.00)(t=6.49,P=0.031)、CO(11.80±1.12)(t=5.77,P=0.036)顯著升高,LVDd(3.10±0.09)(t=4.38,P=0.041)、LVDs(2.13±0.14)(t=5.39,P=0.039)、LVM(51.23±1.89)(t=7.01,P=0.020)顯著降低,見圖3。

圖3 三組小鼠心功能

2.4攜帶miR-122a BMSC-Exos緩解DCM心肌細胞損傷:HE結果顯示,對照組小鼠心肌組織形態(tài)正常,未見炎性細胞浸潤,心肌纖維排列整齊。miR-NC組小鼠心肌組織形態(tài)異常,心肌纖維斷裂。miR-122a組小鼠心肌組織形態(tài)恢復,心肌纖維斷裂恢復,見圖4。Western blot結果顯示,與對照組(0.17±0.02)比較,miR-NC組小鼠心肌組織γH2AX蛋白表達水平(1.17±0.07)顯著升高(t=6.53,P=0.030);與miR-NC組比較,miR-122a組小鼠心肌組織γH2AX蛋白表達水平(0.38±0.11)顯著降低(t=5.57,P=0.037),見圖5。

圖4 三組小鼠心肌組織病理

圖5 三組小鼠心肌組織γH2AX表達

2.5攜帶miR-122a BMSC-Exos降低DCM炎癥水平:ELISA結果顯示,與對照組(2159.12±33.98)(21.80±2.99)(38.74±2.11)(102.99±1.21)比較,miR-NC組小鼠心肌組ROS(3154±29.08)(t=6.69,P=0.024)、IL-1β(40.80±4.81)(t=6.61,P=0.025)、IL-6(70.25±5.90)(t=5.98,P=0.034)和TNF-α(189.77±10.11)(t=3.21,P=0.046)水平顯著升高;與miR-NC組比較,miR-122a組小鼠心肌組織ROS(2350.23±29.76)(t=7.33,P=0.018)、IL-1β(28.70±3.77)(t=7.091,P=0.020)、IL-6(54.30±5.88)(t=6.07,P=0.033)和TNF-α(126.03±10.24)(t=6.91,P=0.022)水平顯著降低,見圖6。

圖6 三組小鼠心肌組織炎癥水平

2.6攜帶miR-122a BMSC-Exos恢復DCM心肌細胞自噬水平:Western blot結果顯示,與對照組(1.41±0.13)(0.81±0.05)比較,miR-NC組小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(0.23±0.07)(t=7.11,P=0.019)、Beclin1(0.33±0.08)(t=4.67,P=0.040)蛋白表達水平顯著降低;與miR-NC組比較,miR-122a組小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(0.73±0.06)(t=10.66,P=0.010)、Beclin1(0.57±0.08)(t=8.33,P=0.014)蛋白表達水平顯著升高,見圖7。

圖7 三組小鼠心肌組織自噬水平

3 討 論

目前臨床上的非藥物治療、藥物治療和手術治療均不能從根本上治療DCM等心臟疾病,因此,基于BMSC的細胞及細胞器療法引起了人們越來越多的關注。作為一種細胞外囊泡,外泌體具備良好的生物相容性、穩(wěn)定性以及較低的毒性,已經成為組織工程和再生醫(yī)學的重要工具。例如BMSC-Exos可通過調節(jié)小膠質細胞M1/M2表型減輕腦缺血再灌注損傷誘導的神經炎癥和細胞焦亡。此外,來自缺氧BMSC-Exos攜帶的microRNA-98-5p可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制心肌缺血再灌注損傷,這表明了BMSC-Exos對于心肌功能性疾病具有潛在的治療作用。

微小RNA(miRNA)可在轉錄后水平調節(jié)基因表達。當給予miR-122治療可以通過靶向Fibulin-1(一種與細胞外基質重塑有關的分泌蛋白)來逆轉糖尿病性心肌病中的心臟肥大和纖維化,強化心臟功能[6],表明miR-122a在心臟功能重塑中起關鍵作用。本實驗通過提取小鼠BMSC,轉染miR-122a后,通過提取BMSC-Exos,鑒定miR-122a的表達,并用于治療DCM。結果發(fā)現攜帶miR-122a BMSC-Exos改善了DCM小鼠的心功能指標,緩解了心肌細胞損傷,促進了心肌組織形態(tài)恢復,抑制心肌纖維斷裂,降低了心肌炎癥細胞浸潤和炎癥因子的表達水平,說明攜帶miR-122a BMSC-Exos對DCM具有較好的治療作用。

自噬是影響心臟形態(tài)發(fā)育的關鍵過程,可保護心肌細胞應對多種應激刺激。然而,自噬紊亂會導致心臟損傷,引發(fā)心臟性疾病,例如心肌病、心肌肥大和缺血/再灌注損傷。據報道,持續(xù)的高血糖和胰島素信號傳導受損可以通過增強心肌細胞中的mTOR信號進一步抑制心臟自噬[7]。此外,糖尿病患者體內過度的心肌炎癥也會通過損害心臟自噬而導致DCM。同時,攝入高脂肪和精制碳水化合物的飲食會導致心臟胰島素代謝信號受損、氧化應激和心臟纖維化[8]。而miR-122a可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導肝細胞自噬介導的細胞凋亡[9]。在本研究中,在給予高脂高糖飲食飼養(yǎng),腹腔注射STZ誘導小鼠DCM后,通過檢測小鼠自噬相關蛋白(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1)的表達,初步發(fā)現DCM小鼠心肌細胞自噬水平降低,這與前人研究結論一致。而使用攜帶miR-122a BMSC-Exos治療后,小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達水平升高,說明攜帶miR-122a BMSC-Exos可以提高DCM小鼠的心肌細胞自噬能力。

綜上所述,本研究在高脂高糖飲食聯合STZ誘導小鼠DCM模型中,心肌細胞自噬水平降低,而攜帶miR-122a的BMSC-Exos可通過恢復心肌細胞自噬水平,降低炎性水平和細胞損傷,改善DCM的疾病癥狀。本研究從恢復DCM患者心臟自噬的角度,揭示攜帶miR-122a的BMSC-Exos對于心臟功能的改善作用,為DCM的臨床治療提供新的治療思路。