代曉陽(yáng)，劉湘寧，葛孚晶，朱宏道，鄭楚潤(rùn)，嚴(yán)芳潔，楊 波

1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058

2.浙江大學(xué)智能創(chuàng)新藥物研究院，浙江 杭州 310018

NSCLC 包括肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，占肺癌的80%～85%，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。約50%的亞洲NSCLC 患者中檢測(cè)到EGFR激活突變［2］，這些患者采用EGFR-TKI 治療后存活率及臨床結(jié)局顯著改善［3］。作為第三代EGFRTKI，奧希替尼對(duì)EGFR 敏感性激活突變以及T790M 耐藥突變細(xì)胞的抑制率更高［4］，是EGFRT790M 突變所致耐藥的NSCLC 患者的一線治療藥物［5］。然而，盡管治療初期患者對(duì)奧希替尼的響應(yīng)率良好，但仍不可避免會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥［6］。因此，探尋奧希替尼的耐藥機(jī)制、開(kāi)發(fā)奧希替尼耐藥的治療策略對(duì)NSCLC 患者的臨床治療具有重要意義。

PLK1屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶的Polo亞家族，在人體具有有絲分裂活性的細(xì)胞和組織中高表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展、分化和存活等多種細(xì)胞過(guò)程［7］。PLK1在多種人類(lèi)惡性腫瘤中高表達(dá)并與患者的不良預(yù)后相關(guān)［8］，有研究報(bào)道PLK1驅(qū)動(dòng)NSCLC 細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)NSCLC轉(zhuǎn)移［9］。近年來(lái)，研究者開(kāi)發(fā)出多款PLK1小分子抑制劑，這些小分子抑制劑在腫瘤臨床前治療研究中展現(xiàn)出良好的活性，但因?yàn)閯┝肯拗菩远靖弊饔眉懊摪行?yīng)在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)欠佳［10］。

本研究在成功構(gòu)建奧希替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞株基礎(chǔ)上，篩選出對(duì)奧希替尼耐藥細(xì)胞有抑制作用的PLK1 抑制劑，并考察了PLK1 抑制劑與奧希替尼的協(xié)同治療效果，旨在為NSCLC 的奧希替尼耐藥問(wèn)題提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人NSCLC細(xì)胞株NCI-H1975購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；NCI-H1975敏感株與耐藥株源自GSE146850 隊(duì)列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE146850），PC-9敏感株與PC-9 耐藥株源自GSE153183 隊(duì)列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE153183）。腫瘤經(jīng)典通路抑制劑化合物庫(kù)（L3500）為美國(guó)Selleck 公司產(chǎn)品；奧希替尼、PLK1 抑制劑為美國(guó)MedChemExpress 公司產(chǎn)品；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為美國(guó)Invitrogen 公司產(chǎn)品；Tris-base 為德國(guó)BioFroxx 公司產(chǎn)品；SRB 為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

細(xì)胞培養(yǎng)箱與生物安全柜為美國(guó)Thermo Electron 公司產(chǎn)品；普通倒置顯微鏡為日本Leica公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NCI-H1975 細(xì)胞在添加了10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有細(xì)胞均置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%二氧化碳）中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至合適密度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)0.05%胰蛋白酶消化傳代，所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均傳代不超過(guò)十次。

1.3 藥物濃度遞增法構(gòu)建耐藥株

取匯合度60%～80%的人NSCLC 細(xì)胞株NCIH1975（即藥物敏感細(xì)胞株，記為H1975 敏感細(xì)胞），在培養(yǎng)基加入1 nmol/L 的奧希替尼，培養(yǎng)24 h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)。若細(xì)胞大量死亡則棄含藥培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液清洗，更換不含藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)速度至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化傳代后再次加入1 nmol/L 奧希替尼培養(yǎng)24 h，及時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞仍大量死亡則繼續(xù)做撤藥處理，待細(xì)胞增殖至正常狀態(tài)后，重復(fù)上述循環(huán)，直至當(dāng)細(xì)胞在1 nmol/L 奧希替尼培養(yǎng)條件下穩(wěn)定增殖并連續(xù)傳代三次以上。按20 nmol/L的藥物濃度差提升奧希替尼濃度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。若細(xì)胞增殖速度異常緩慢或大量死亡，則更換為原含1 nmol/L 奧希替尼的培養(yǎng)基，待其恢復(fù)至正常增殖速度后再次更換為篩選濃度培養(yǎng)基。重復(fù)上述循環(huán)，直至細(xì)胞在該篩選藥物濃度培養(yǎng)條件下穩(wěn)定增殖并連續(xù)傳代三次以上。期間需在不同時(shí)間段測(cè)量細(xì)胞對(duì)于奧希替尼的IC50以確定耐藥指數(shù)，耐藥指數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。耐藥株構(gòu)建時(shí)間共計(jì)7個(gè)月，最終細(xì)胞維持培養(yǎng)濃度為1 μmol/L，耐藥株記為H1975 耐藥細(xì)胞。

1.4 腫瘤經(jīng)典通路抑制劑庫(kù)篩選與奧希替尼具有協(xié)同作用的化合物

將腫瘤經(jīng)典通路抑制劑庫(kù)中化合物（0.1 μmol/L）與奧希替尼（0.5 μmol/L）聯(lián)合用于H1975 耐藥株中，使用SRB 染色檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞株的增殖抑制率，以單用奧希替尼（0.5 μmol/L）的細(xì)胞株增殖抑制率為對(duì)照，篩選出腫瘤經(jīng)典通路抑制劑庫(kù)中與奧希替尼存在協(xié)同作用的化合物。

1.5 SRB染色法考察細(xì)胞存活率

H1975 敏感細(xì)胞和H1975 耐藥細(xì)胞分別以3.0×104個(gè)/孔 的 細(xì) 胞 密 度 接 種 于96 孔 板 中（100 μL/孔），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，給予梯度濃度的相應(yīng)化合物孵育72 h。孵育結(jié)束棄去上清液，每孔加入100 μL 10%三氯乙酸溶液固定，棄培養(yǎng)液，用雙蒸水洗滌后烘干。每孔加入100 μL SRB 染色液（用1%冰醋酸配置，每500 mL 加 入1.5～2.0 g SRB 粉 末），室 溫 放 置20 min，用1%冰醋酸洗滌干凈后烘干。每孔加入100 μL Tris-base 堿溶液溶解結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)的SRB染色液，置于室溫?fù)u床20 min后，檢測(cè)515 nm波長(zhǎng)處的吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 差異基因富集分析考察耐藥株中PLK1 信號(hào)通路的變化情況

選取GSE146850 隊(duì)列中H1975 奧希替尼耐藥株與敏感株以及GSE153183 隊(duì)列中PC-9 耐藥株與敏感株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用R 軟件包limma 3.42.2對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較并計(jì)算差異基因，篩選差異基因標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05 且log2FC的絕對(duì)值大于1。對(duì)分析得到的差異基因采用R 軟件包c(diǎn)lusterProfiler 4.0 進(jìn)行基因集富集分析，評(píng)估差異基因中相關(guān)信號(hào)通路的富集情況。

1.7 采用NSCLC 患者隊(duì)列數(shù)據(jù)分析PLK1 表達(dá)水平與患者無(wú)進(jìn)展生存期的相關(guān)性

選取11例接受過(guò)奧希替尼治療后的EGFR 突變的NSCLC 患者的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)與生存隨訪數(shù)據(jù)（https://github.com/aleighbrown/pwgs_snakemake），采用皮爾遜相關(guān)性分析考察患者PLK1mRNA 表達(dá)水平與患者無(wú)進(jìn)展生存期的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采 用RStudio（R 軟 件 包ggplot2）、Excel 和Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和繪圖。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用雙側(cè)student’st檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 奧希替尼耐藥株構(gòu)建成功

SRB 染色結(jié)果見(jiàn)圖1。H1975 敏感細(xì)胞多呈多邊形，細(xì)胞輪廓明顯，易成團(tuán)生長(zhǎng)；H1975耐藥細(xì)胞多呈梭形，輪廓不規(guī)則，分散程度較高。處理72 h 后奧希替尼對(duì)H1975 耐藥細(xì)胞的IC50顯著高于H1975 敏感細(xì)胞（分別為1550.00和35.67 nmol/L，P＜0.05），耐藥指數(shù)為43.45，見(jiàn)圖2。表明H1975 耐藥株構(gòu)建成功。

圖1 奧希替尼敏感和耐藥H1975細(xì)胞顯微鏡下形態(tài)Figure 1 Cell morphology of osimertinib sensitive and resistant H1975 cell lines

圖2 奧希替尼處理72 h 后敏感和耐藥H1975 細(xì)胞的生存曲線Figure 2 Cell survival curves of osimertinib sensitive and resistant H1975 cells

2.2 篩選出與奧希替尼具有協(xié)同作用的腫瘤經(jīng)典通路抑制劑

SRB 染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)濃度下單用奧希替尼對(duì)H1975耐藥細(xì)胞的增殖抑制率為35.80%；而將腫瘤經(jīng)典通路抑制劑庫(kù)中化合物（0.1 μmol/L）與奧希替尼（0.5 μmol/L）聯(lián)合作用72 h，抑制率前十的化合物見(jiàn)表1。其中合用抑制率排名前二的化合物為PLK1 抑制劑GSK 461364 和BI 2536，與奧希替尼合用后對(duì)H1975 耐藥株的抑制率分別達(dá)到90.10% 和87.90%。表明PLK1 抑制劑GSK 461364、BI 2536 與奧希替尼合用能夠顯著抑制奧希替尼耐藥細(xì)胞的增殖，提示奧希替尼的耐藥現(xiàn)象可能與NSCLC中PLK1異常激活相關(guān)。

表1 與奧希替尼合用72 h 對(duì)耐藥H1975 細(xì)胞抑制率排名前十的腫瘤經(jīng)典通路抑制劑及其靶點(diǎn)Table 1 Top10 tumor classic pathway inhibitor and their targets in terms of inhibition rate of osimertinibresistant cells after 72 hours of combined use of osimertinib

2.3 奧希替尼耐藥可能與PLK1通路激活有關(guān)

奧希替尼耐藥株（H1975 耐藥細(xì)胞與PC-9 耐藥細(xì)胞）中PLK1 調(diào)控通路和細(xì)胞周期通路被顯著激活（P＜0.01），見(jiàn)圖3。同時(shí)，在接受奧希替尼治療的EGFR 突變NSCLC 患者隊(duì)列中，奧希替尼治療后患者的PLK1mRNA 水平與無(wú)進(jìn)展生存期呈負(fù)相關(guān)（R=-0.62，P＜0.05），見(jiàn)圖4。結(jié)果提示，NSCLC 細(xì)胞中PLK1 過(guò)度激活可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)奧希替尼耐藥。

圖3 奧希替尼耐藥株與親本敏感株中PLK1調(diào)控通路和細(xì)胞周期通路相關(guān)基因富集結(jié)果Figure 3 Activation of PLK1 regulatory pathway and cell cycle pathway in samples of osimertinib resistant cells and parental sensitive cells

圖4 接受奧希替尼治療的EGFR 突變非小細(xì)胞癌患者中PLK1 mRNA 水平與無(wú)進(jìn)展生存期的相關(guān)性Figure 4 The correlation between PLK1 mRNA levels and progress free survival in a cohort of EGFR mutated NSCLC patients receiving osimertinib treatment

2.4 奧希替尼耐藥細(xì)胞對(duì)PLK1抑制劑更敏感

采用PLK1單靶點(diǎn)抑制劑伏拉塞替（BI 6727）和GSK 461364 進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)。SRB 染色結(jié)果顯示，伏拉塞替和GSK 461364 作用72 h后，H1975 耐 藥 細(xì) 胞 的IC50（分 別 為19.36 和8.24 nmol/L）顯著低于H1975 敏感細(xì)胞（分別為37.83 和28.54 nmol/L，均P＜0.05），見(jiàn)圖5，表明奧希替尼耐藥細(xì)胞對(duì)PLK1抑制劑更敏感。

圖5 伏拉塞替或GSK 461364 作用后奧希替尼敏感和耐藥H1975細(xì)胞的生存曲線Figure 5 Cell survival curves of osimertinib sensitive and resistant H1975 cells treated with BI 6727 or GSK 461364

2.5 PLK1 抑制劑與奧希替尼合用可增強(qiáng)對(duì)耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用

根據(jù)上述結(jié)果，選擇對(duì)H1975 耐藥細(xì)胞增殖抑制率約在30%的PLK1 抑制劑濃度與奧希替尼合用。伏拉塞替（12.5 nmol/L）和GSK 461364（6.25 nmol/L）分別與奧希替尼聯(lián)合作用于H1975耐藥細(xì)胞72 h后，H1975耐藥細(xì)胞的存活率較單用奧希替尼組顯著降低（均P＜0.05，圖6），表明PLK1抑制劑與奧希替尼合用可增強(qiáng)對(duì)耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用，提示合用PLK1抑制劑與奧希替尼可能是解決臨床NSCLC奧希替尼耐藥的新途徑。

圖6 伏拉塞替或GSK 461364聯(lián)合奧希替尼作用后H1975耐藥細(xì)胞的生存曲線Figure 6 Cell survival curves of osimertinib resistant H1975 cells treated by BI 6727 or GSK 461364 combined with osimertinib

3 討 論

NSCLC 是世界上最為常見(jiàn)的癌癥相關(guān)死亡原因之一，全球每年死亡人數(shù)超過(guò)8 萬(wàn)人［11］。約50%的亞洲NSCLC 患者和11%～16%的西方國(guó)家NSCLC 患者攜帶EGFR 突變［2］。數(shù)據(jù)顯示，攜帶EGFR 敏感突變的患者獲益于EGFR-TKI，其客觀緩解率與無(wú)進(jìn)展生存期有效改善［12］。

然而，作為攜帶EGFR 突變的NSCLC 患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療手段，第一代與第二代EGFR-TKI如吉非替尼和阿法替尼等雖然在患者中顯示出良好的臨床收益，但多數(shù)患者在治療后產(chǎn)生獲得性耐藥［13］。為了解決第一、二代EGFR-TKI 耐藥問(wèn)題，研究者開(kāi)發(fā)了第三代EGFR-TKI 奧希替尼用于對(duì)EGFR-TKI 獲得性耐藥的T790M 陽(yáng)性NSCLC 患者［14］。奧希替尼在T790M 驅(qū)動(dòng)的第一代EGFR-TKI 獲得性耐藥患者中顯示出優(yōu)越的療效及更低的皮膚和胃腸道毒性［15］。然而與早期EGFR-TKI 類(lèi)似，接受奧希替尼治療的患者依然不可避免地出現(xiàn)獲得性耐藥?，F(xiàn)有研究揭露的耐藥機(jī)制可分為EGFR 依賴性耐藥和EGFR 非依賴性耐藥［16］。EGFR 依賴性耐藥機(jī)制主要包括EGFR 三 級(jí) 突 變 如EGFR-C797、EGFR-L718 和EGFR-G719 突變等類(lèi)型，阻礙奧希替尼與EGFR之間形成共價(jià)結(jié)合，從而賦予患者耐藥性［17］。EGFR 非依賴性耐藥機(jī)制主要包括旁路途徑激活、組織學(xué)轉(zhuǎn)化和致癌融合等［18］。目前，c-MET擴(kuò)增是奧希替尼最常見(jiàn)的EGFR 非依賴性耐藥機(jī)制，占奧希替尼進(jìn)展患者的5%～24%，c-MET 通過(guò)與配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合，導(dǎo)致受體磷酸化并激活EGFR 下游信號(hào)通路的旁路導(dǎo)致奧希替尼耐藥［19］；EGFR 下游信號(hào)通路如PI3K-AKT、RASMAPK-ERK、JAK-STAT 等異常激活也會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生、增殖、遷移、侵襲和對(duì)治療的抵抗［20］；除此之外，含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域6與RET融合等致癌融合突變也會(huì)賦予患者奧希替尼耐藥性［21］。盡管在表征奧希替尼的部分分子耐藥性方面已經(jīng)取得了進(jìn)展，但由于耐藥性的異質(zhì)性和復(fù)雜性，仍有30%～50%患者的耐藥機(jī)制仍未明確［22］。

聯(lián)合其他分子靶向藥物是一種解決或延緩?qiáng)W希替尼耐藥的治療策略。目前，奧希替尼聯(lián)合c-MET 抑制劑沃利替尼、MEK 抑制劑司美替尼或RET 抑制劑普拉替尼等多種分子靶向藥物的臨床試驗(yàn)顯示出良好的腫瘤治療作用與可控的毒副作用［23-25］。基于此，本研究首先成功構(gòu)建了奧希替尼耐藥株，并將腫瘤經(jīng)典通路抑制劑庫(kù)中的化合物與奧希替尼合用，旨在篩選出能有效克服奧希替尼耐藥的藥物組合。結(jié)果顯示，在所有化合物中，PLK1 抑制劑GSK 461364 和BI 2536 與奧希替尼合用后對(duì)奧希替尼耐藥株的增殖抑制率最高。結(jié)合基因集富集分析結(jié)果，奧希替尼耐藥株樣本中PLK1 調(diào)控通路和細(xì)胞周期通路顯著激活，表明NSCLC 細(xì)胞對(duì)奧希替尼耐藥可能與PLK1 過(guò)度激活有關(guān)，提示聯(lián)合使用PLK1 抑制劑與奧希替尼可能是臨床上解決NSCLC 患者奧希替尼耐藥的新途徑。接著，本研究在細(xì)胞水平考察了奧希替尼敏感和耐藥細(xì)胞對(duì)PLK1 抑制劑的敏感性，結(jié)果顯示奧希替尼耐藥細(xì)胞對(duì)PLK1 抑制劑更加敏感，且PLK1 抑制劑與奧希替尼合用對(duì)奧希替尼耐藥細(xì)胞的增殖有較好的抑制作用。

PLK1 作為絲/蘇氨酸蛋白激酶的Polo 亞家族成員，在有絲分裂和維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展、分化和存活等多種細(xì)胞過(guò)程［7］。相較于靶向微管等傳統(tǒng)抗有絲分裂藥物，靶向有絲分裂調(diào)節(jié)激酶PLK1 可降低其在正常細(xì)胞中的微管抑制而產(chǎn)生的毒副作用［26］。作為具有癌癥治療潛力的靶點(diǎn)，近年來(lái)，研究者開(kāi)發(fā)了多種PLK1 抑制劑并進(jìn)入臨床試驗(yàn)。本文所使用的PLK1 抑制劑伏拉塞替以及GSK 461364均為ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，其中伏拉塞替為二氫蝶酮衍生物類(lèi)化合物，與PLK1 的激酶結(jié)構(gòu)域R57、L59 和C133 等殘基通過(guò)氫鍵相互作用［27］；GSK 461364 為噻吩衍生類(lèi)化合物，其對(duì)PLK1 具有高度選擇性［28］。目前，研究進(jìn)展最快的PLK1 抑制劑伏拉塞替在多組臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤活性及安全性，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局稱(chēng)為治療急性髓性白血病的“突破性療法”［29］。然而，目前開(kāi)發(fā)的PLK1 抑制劑大多靶向PLK1 的ATP 結(jié)合位點(diǎn)，PLK 家族ATP 結(jié)合口袋的高度保守性使得多數(shù)化合物不可避免地面臨脫靶效應(yīng)，單藥治療時(shí)抑制劑的非特異性活性常導(dǎo)致劑量限制性毒性［30］。實(shí)體腫瘤對(duì)單一PLK1 抑制劑的反應(yīng)有限［31］。目前尚未有一款成熟的PLK1抑制劑進(jìn)入臨床。

本研究初步揭示了PLK1 可能是解決臨床奧希替尼耐藥的有效靶點(diǎn)。關(guān)于合用PLK1 抑制劑與奧希替尼增強(qiáng)對(duì)耐藥細(xì)胞抗腫瘤作用的具體機(jī)制，有研究揭示了PLK1抑制劑伏拉塞替與厄洛替尼合用可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的DNA 損傷以及G2/M 停滯并引發(fā)細(xì)胞凋亡［32］。除此之外，在EGFR-TKI獲得性耐藥的NSCLC 患者腫瘤標(biāo)本中有絲分裂調(diào)控激酶Aurora B 表達(dá)增加且明顯激活［33-34］，而PLK1 通過(guò)在Thr236 位點(diǎn)上磷酸化Aurora B 調(diào)控其激酶活性［35-36］。推測(cè)抑制PLK1 可能通過(guò)進(jìn)一步抑制Aurora B激酶活性從而增強(qiáng)奧希替尼對(duì)耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用。

綜上所述，本研究通過(guò)體外篩選、細(xì)胞水平評(píng)估和生物信息學(xué)分析證實(shí)，PLK1 的異常激活可能是奧希替尼耐藥的新機(jī)制，PLK1 抑制劑與奧希替尼合用對(duì)奧希替尼耐藥細(xì)胞的抗腫瘤作用更強(qiáng)，可為奧希替尼耐藥的NSCLC 患者的臨床治療提供了新的思路。

志謝 研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（82104193）和浙江省自然科學(xué)基金（LY22H310001）支持

Acknowledgements This work was supported by National Natural Science Foundation of China (82104193) and Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY22H310001)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)