周鶴，章順

九江市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，江西 九江 332000

感冒止咳顆粒是由柴胡、黃芩、桔梗、青蒿、連翹、葛根、山銀花、苦杏仁、薄荷腦等九味中藥組成，可用于治療因外感風(fēng)熱引起的咳嗽癥狀［1］。方中柴胡、山銀花疏散退熱，共同為君藥；葛根具有解肌退熱的功效，青蒿可緩解虛熱，而連翹和黃芩則可清熱解毒，共為臣藥；桔梗與苦杏仁共同發(fā)揮宣降肺氣、止咳化痰的功效，而薄荷腦芳香辛散則作為輔助藥物，與其他藥物協(xié)同作用，起到清熱解表、止咳化痰的效果。感冒止咳顆粒具有疏風(fēng)宣肺，清里透表之功效，臨床上主要治療風(fēng)寒表證引起的咳喘及小兒發(fā)熱惡寒等癥［2］。目前，感冒止咳顆粒的法定標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2020 年版一部，標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了黃芩苷的含量測(cè)定項(xiàng)目。查閱相關(guān)文獻(xiàn)［3-6］，未有感冒止咳顆粒中君藥柴胡的含量測(cè)定方法研究。本研究建立了感冒止咳顆粒中柴胡的薄層色譜法和柴胡皂苷a 的高效液相色譜法，對(duì)13 個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的45 批感冒止咳顆粒進(jìn)行了柴胡的定性和定量分析，以便更全面地反映感冒止咳顆粒的質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695 HPLC 色譜儀（waters 公司）；Jp080s 型超聲機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（Camag 公司）；AGF285 型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）。

1.2 對(duì)照品

柴胡皂苷a 對(duì)照品（批號(hào)：110777-201912，含量94.8%）；柴胡皂苷d 對(duì)照品（批號(hào)：110778-201912，含量96.3%）；柴胡對(duì)照藥材（批號(hào)：120992-201509）；均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 樣品

共有13 個(gè)企業(yè)的45 批次感冒止咳顆粒樣品，其中生產(chǎn)企業(yè)A 8 批，生產(chǎn)企業(yè)B 9 批，生產(chǎn)企業(yè)C 5 批，生產(chǎn)企業(yè)D 4 批，生產(chǎn)企業(yè)E、F 各3 批，生產(chǎn)企業(yè)G、H、I、J、K、L 各2 批，生產(chǎn)企業(yè)M1 批。按感冒止咳顆粒處方制備缺柴胡陰性對(duì)照樣品。

1.4 試劑

硅膠G 薄層色譜板（德國(guó)默克公司，批號(hào)：HX90656226）；超純水；乙腈、磷酸為色譜純；對(duì)二甲氨基苯甲醛（麥克林，批號(hào)C11854367）；乙酸乙酯、乙醇、甲醇、正丁醇、氨水、硫酸均為分析純。

2 柴胡薄層色譜鑒別

取樣品20 g，研細(xì)，加甲醇50 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，加正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，棄去氨洗液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次30 mL，棄去水洗液，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取柴胡對(duì)照藥材約1.0 g，加甲醇25 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 各含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺柴胡陰性對(duì)照樣品，同法制備陰性對(duì)照溶液。吸取上述五種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液［1］，60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視［7-8］。

薄層色譜結(jié)果表明：供試品色譜中在與柴胡皂苷a 對(duì)照品和柴胡對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；在與柴胡皂苷d 對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，未顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。

3 柴胡皂苷的液相鑒別

3.1 色譜條件

Waters e2695-2424 型 HPLC 色譜-ELSD 檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（81∶19）；流速0.7 mL/min；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。ELSD 檢測(cè)器檢測(cè)參數(shù)：載氣（N2）體積流量2.38 SLPM/min，漂移管溫度90 ℃。

3.2 溶液配制

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備稱取柴胡皂苷a 對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成含柴胡皂苷a0.387 7mg/mL 的溶液。

3.2.2 供試品溶液的制備取樣品約20 g，研細(xì)，精密稱定，加甲醇50 mL 超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2 次，每次20 mL，棄去氨洗液，再用正丁醇飽和的水洗滌2 次，每次30 mL，棄去水洗液，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL 量瓶，作為供試品溶液。

3.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備稱取缺柴胡陰性對(duì)照樣品約20 g，同“3.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和方法學(xué)考察

3.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 感冒止咳顆粒HPLC色譜圖：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液

3.3.2 線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液10 μL和30 μL，注入液相色譜儀測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量（μg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制log-log 標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明：柴胡皂苷a 在3.877～11.63 μg 范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量呈良好的log-log 線性關(guān)系，回歸方程y=1.003 936x+5.258 356，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

3.3.3 精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，結(jié)果柴胡皂苷a 峰面積的RSD 為0.5%，表明儀器精密度良好。

3.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)取樣品（批號(hào)：ZCB2106）6 份，各約20 g，按“3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果柴胡皂苷a 平均含量為0.052 5 mg/g，RSD 為0.8%。

3.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液中柴胡皂苷a 峰面積RSD 為0.3%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.6 回收率試驗(yàn)采用加樣回收試驗(yàn)，取已知含量的樣品（批號(hào)：ZCB2106）6 份，各約10 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.035 7 mg/mL 的柴胡皂苷a 對(duì)照品溶液15 mL，按“3.2.2”項(xiàng)下方法分別制備6 份回收率供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為96.8%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度較高。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 柴胡皂苷a回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.3.7 檢測(cè)限考察取對(duì)照品溶液用甲醇進(jìn)行逐級(jí)稀釋并進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比（S/N）為3 時(shí)，柴胡皂苷a 的檢出限為0.007 mg/mL。

3.4 樣品測(cè)定

45 批樣品按上述方法進(jìn)行柴胡皂苷a 的測(cè)定，計(jì)算樣品中柴胡皂苷a 含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各企業(yè)樣品中柴胡皂苷a的含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

4 討論

由于柴胡皂苷a、d 分子中環(huán)氧結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致在生產(chǎn)工藝水煎煮過(guò)程中大量轉(zhuǎn)化成柴胡皂苷b1和b2。在本研究中，樣品的制備過(guò)程在堿性條件下提取，盡量減少柴胡皂苷a、d 的轉(zhuǎn)化。但試驗(yàn)結(jié)果為柴胡皂苷d 均未檢出，柴胡皂苷a 部分被轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致兩種皂苷含量的不確定性［9-10］，這也是目前眾多柴胡制劑標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)柴胡皂苷控制的主要原因。

本研究針對(duì)13 個(gè)企業(yè)的45 批次樣品進(jìn)行柴胡、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的薄層鑒別，結(jié)果所有批次樣品中均未檢出柴胡皂苷d，原因可能是在柴胡飲片煎煮加工過(guò)程中，柴胡皂苷d 易出現(xiàn)水解的現(xiàn)象，使得柴胡皂苷d 無(wú)法檢出。柴胡皂苷a 薄層色譜檢測(cè)結(jié)果與HPLC 檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明所建立的薄層色譜具有較高的準(zhǔn)確度，可以用于識(shí)別感冒止咳顆粒中的柴胡皂苷a。

根據(jù)表2 結(jié)果，共有16 個(gè)批次樣品未檢出柴胡皂苷a，檢出柴胡皂苷a 的樣品含量在0.007 3～0.052 5 mg/g 之間，最高含量和最低含量之間相差7.2倍。不同企業(yè)或同一企業(yè)不同批次樣品中柴胡皂苷a 含量差異較大，可能與藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)、生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)。其中企業(yè)B 生產(chǎn)的9 個(gè)批次樣品中均未檢出柴胡皂苷a，具體原因有待進(jìn)一步研究，提示相關(guān)企業(yè)及監(jiān)管部門(mén)應(yīng)引起重視。