李佳蕊，韓彬，張雪霞，任鳳芝，徐艷梅，閆凱，王巧，高燕霞

1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050021；2.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050021；3.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017

阿莫西林是口服半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素，抗菌譜廣，是兒童及成人院外感染性疾病常用藥［1］，但其高發(fā)的過敏反應(yīng)，尤其是過敏性休克，嚴(yán)重危害人民生命健康，需引起高度重視。已有研究［2-4］得知，阿莫西林過敏反應(yīng)主要由聚合物引發(fā)。另有文獻(xiàn)［5］報(bào)道，口服阿莫西林制劑聚合物含量與制劑中水分等工藝屬性呈正相關(guān)。因此，聚合物雜質(zhì)的控制，是阿莫西林顆粒關(guān)鍵質(zhì)量屬性，然而該品種現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《中國藥典》2020 年版二部，未對(duì)該類雜質(zhì)進(jìn)行控制。

參考文獻(xiàn)［6］方法，同時(shí)結(jié)合《中國藥典》2020年版阿莫西林原料有關(guān)物質(zhì)測(cè)定法［7］，建立C18 色譜柱-高效液相色譜法測(cè)定6 批國產(chǎn)制劑樣品及2批原研制劑樣品中聚合物雜質(zhì)，同時(shí)分離出的雜質(zhì)用二維液相-在線脫鹽-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)采用二維液相-閥切換-在線脫鹽-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（2D-LC-IT-TOF-MS/MS ）對(duì)聚合物雜質(zhì)進(jìn)行鑒定［8-9］，該方法不改變?cè)鲃?dòng)相條件，通過閥切換功能，棄去不能進(jìn)入質(zhì)譜的流動(dòng)相組分，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)雜質(zhì)精準(zhǔn)定位的液質(zhì)聯(lián)用分析［10］，其中1stD-LC（一維液相）使用《中國藥典》該品種有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，通過共用的組分收集環(huán)捕集目標(biāo)雜質(zhì)；在1stD-LC 分析結(jié)束后，收集環(huán)中的雜質(zhì)依次進(jìn)行2ndD-LC（二維液相）分析，其中2ndD-LC色譜柱條件是適合進(jìn)入質(zhì)譜分析的流動(dòng)相［9-12］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

本實(shí)驗(yàn)使用島津2D-LC-IT-TOF-MS/MS 系統(tǒng)。具體配置為LC-20AD 輸液泵，SIL-20AC 自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC（柱溫箱），CBM-20A（系統(tǒng)控制器），DGU-20A5（在線脫氣機(jī)），SPD-M20A（二極管陣列檢測(cè)器），SPD-20A（UV 檢測(cè)器），F(xiàn)CV-12AH×3（流路選擇閥），F(xiàn)CV-14AH×2（色譜柱切換閥），LCMS-IT-TOF（離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀）和LC MS solution Ver.3.70（色譜工作站）。

1.2 試藥

阿莫西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品（批號(hào)130608—201804，購買自中國食品藥品檢定研究院）。阿莫西林顆粒（規(guī)格：0.25 g，批號(hào)：F8082901、F8082902、F8 082903；規(guī)格：0.125 g，批號(hào)：F9022901、F9022902、F9 022903；廠家：河北某廠家）。原研樣品（規(guī)格：250 mg/5 mL，批號(hào)：536R；規(guī)格：125 mg/5 mL，批號(hào)：V78F；廠家：葛蘭素史克公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件

1stD-LC 色譜條件。色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長：230 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相A：0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（取0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，用2 mol/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 值至5.0）-乙腈（99∶1）；流動(dòng)相B：0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）-乙腈（80∶20）；先以流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（92∶8）等度洗脫，待阿莫西林峰洗脫完畢后立即按表1 線性梯度洗脫［13］。

表1 梯度洗脫程序

2ndD-LC 色譜條件。色譜柱：InertSustainTMC18（2.1 mm×50 mm，2 μm）；檢測(cè)波長：230 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4 ℃；流動(dòng)相：水-乙腈（70∶30）等度洗脫。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI（+）和ESI（-）離子源；接口電壓1.5 kV；霧化氣：氮?dú)?.5 L/min；干燥氣：氮?dú)?0 L/min；碰撞氣：氬氣；脫溶劑管溫度：150 ℃；加熱模塊溫度：150 ℃；檢測(cè)器電壓：1.6 kV；一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m/z200～3 000；二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：m/z200～1 500；校準(zhǔn)方法：自動(dòng)調(diào)諧，外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)。

2.3 分析用樣品溶液配制

精密稱取阿莫西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品，用流動(dòng)相A 溶解并定量稀釋成2 mg/mL 溶液，作為阿莫西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液；阿莫西林顆粒活性成分為阿莫西林三水合物，為了得到更多的阿莫西林聚合物，取過效期樣品約2.5 g，置10 mL 量瓶中，加pH 6.0 磷酸二氫鉀緩沖液溶解，室溫放置72 h 后，作為阿莫西林聚合物混合溶液［14］。

2.4 1stD-LC 色譜分析

精密量取阿莫西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液和阿莫西林聚合物混合溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，記錄色譜圖。

阿莫西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液色譜圖如圖2所示，阿莫西林主峰、已知二聚體和三聚體的出峰時(shí)間，分別為6.637 min、28.516 min 和32.509 min。

阿莫西林聚合物混合溶液在該色譜系統(tǒng)中出峰如圖3 所示，阿莫西林主峰出峰時(shí)間為6.625 min，與圖1 一致，故推測(cè)28.623 min 處為阿莫西林二聚體，32.575 min 處為阿莫西林三聚體，并且檢出的雜質(zhì)峰中存在阿莫西林更高聚合體的可能。

圖1 2D-LC-IT-TOF-MS/MS 雜質(zhì)鑒定系統(tǒng)流路圖

圖2 阿莫西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 阿莫西林聚合物混合溶液色譜圖

LOOP 環(huán)捕集保留時(shí)間分別為6.625 min（阿莫西林主峰），28.623 min（未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F1），32.575 min（未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F2），35.480 min（未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F3），37.797 min（未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F4），38.397 min（未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F5）的目標(biāo)雜質(zhì)峰，用于LC/MS-IT-TOF 測(cè)定。

2.5 阿莫西林主峰高分辨質(zhì)譜

阿莫西林分子式為C16H19N3O5S，應(yīng)用分子量計(jì)算軟件得理論分子量為365.104 5，質(zhì)譜圖見圖4，其中m/z366.102 9 為［M+H］+，與計(jì)算分子量一致。

圖4 阿莫西林主峰質(zhì)譜圖

圖5 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F1多級(jí)質(zhì)譜圖：A.正離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖；B.正離子模式二級(jí)質(zhì)譜圖；C.負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖

2.6 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F1（28.623 min）

一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z731.214 2 的離子推測(cè)為［M+H］+，說明目標(biāo)峰相對(duì)分子量為730.214 2，是阿莫西林理論分子量2 倍，m/z366.109 1 碎片推測(cè)為聚合位點(diǎn)的酰胺鍵斷裂形成的阿莫西林單體碎片。在二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z572.178 8 和m/z413.144 4碎片離子，說明分子中存在2個(gè)159 Da的青霉素母核。

負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z729.200 2 的離子推測(cè)為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測(cè)28.623 min 處未知目標(biāo)雜質(zhì)峰為阿莫西林二聚體。

2.7 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F2（32.575 min）

一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z1 096.285 3、m/z1 134.268 7的離子，推測(cè)分別為［M+H］+和［M+K］+，說明目標(biāo)峰相對(duì)分子量為1 095.313 8，是阿莫西林理論分子量3 倍，而m/z732.263 3 碎片推測(cè)為聚合位點(diǎn)的酰胺鍵斷裂形成的阿莫西林二聚體碎片，見圖6A。在二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z937.289 3、m/z778.244 5 和m/z619.211 1 碎片離子，說明分子中存在3 個(gè)159 Da 的青霉素母核，見圖6B。

圖6 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F2多級(jí)質(zhì)譜圖：A.正離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖；B.正離子模式二級(jí)質(zhì)譜圖；C.負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖

負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z1 094.297 5 的離子推測(cè)為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測(cè)32.575 min 處未知目標(biāo)雜質(zhì)峰為阿莫西林三聚體，見圖6C。

2.8 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F3（35.480 min）

一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z1 461.612 5、m/z1 499.579 2的離子，推測(cè)分別為［M+H］+和［M+K］+，說明目標(biāo)峰相對(duì)分子量為1 460.612 5，是阿莫西林理論分子量4 倍，而m/z1 096.286 3 碎片推測(cè)為聚合位點(diǎn)的酰胺鍵斷裂形成的阿莫西林三聚體碎片（圖7A）。在二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z1 461.785 2、m/z1 302.477 1、m/z 1 144.357 3 和m/z985.311 4 碎片離子，說明分子中存在4 個(gè)159 Da 的青霉素母核（圖7B）。

圖7 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F3多級(jí)質(zhì)譜圖：A.正離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖；B.正離子模式二級(jí)質(zhì)譜圖；C.負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖

負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z 1 459.430 5 的離子推測(cè)為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測(cè)35.480 min 處未知目標(biāo)雜質(zhì)峰為阿莫西林四聚體（圖7C）。

2.9 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F4（37.797 min）

一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z1 826.554 4 的離子推測(cè)為［M+H］+，說明目標(biāo)峰相對(duì)分子量為1 825.554 4，是阿莫西林理論分子量5 倍（圖8A）。在二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z1 667.472 7、m/z1 508.452 7、m/z1 349.413 6、m/z 1 190.387 6 和m/z1 031.340 5 碎片離子，說明分子中存在5 個(gè)159 Da 的青霉素母核（圖8B）。

圖8 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F4多級(jí)質(zhì)譜圖：A.正離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖；B.正離子模式二級(jí)質(zhì)譜圖；C.負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖

負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z1 824.489 2 的離子推測(cè)為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測(cè)37.797 min 處未知目標(biāo)雜質(zhì)峰為阿莫西林五聚體（圖8C）。

2.10 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F5（38.397 min）

一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z2 191.581 9 的離子，推測(cè)為［M+H］+，說明目標(biāo)峰相對(duì)分子量為2 190.581 9，是阿莫西林理論分子量6 倍（圖9A）。在二級(jí)質(zhì)譜圖中存在m/z1 096.281 8 碎片離子,為阿莫西林三聚體碎片（圖9B）。

圖9 未知目標(biāo)雜質(zhì)峰F5質(zhì)譜圖：A.正離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖；B.正離子模式二級(jí)質(zhì)譜圖；C.負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖

負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖中m/z2 189.563 2 的離子推測(cè)為［M-H］-，與正離子模式一致，因此，推測(cè)38.397 min 處未知目標(biāo)雜質(zhì)峰為阿莫西林六聚體（圖9C）。

經(jīng)上述分析結(jié)果表明，阿莫西林可產(chǎn)生的聚合物雜質(zhì)——阿莫西林二聚體、阿莫西林三聚體、阿莫西林四聚體、阿莫西林五聚體、阿莫西林六聚體，在測(cè)試用色譜條件下，均可得到有效分離。

3 樣品測(cè)定

分別取6 批樣品，2 批原研樣品，按照“2.1”項(xiàng)下液相條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖10～12，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果 %

圖10 國產(chǎn)制劑有關(guān)物質(zhì)色譜圖（批號(hào)：F8082901）

圖11 原研樣品有關(guān)物質(zhì)色譜圖（批號(hào)：V78F）

圖12 阿莫西林對(duì)照溶液色譜圖

4 結(jié)論

本研究建立的高聚物測(cè)定方法靈敏、準(zhǔn)確，可在檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)的同時(shí)進(jìn)行聚合物的控制，其中阿莫西林四聚體、五聚體和六聚體為首次檢出。

對(duì)比《中國藥典》2020 年版二部收載的阿莫西林原料有關(guān)物質(zhì)檢查方法中254 nm 檢測(cè)波長，阿莫西林各雜質(zhì)在230 nm 處有更強(qiáng)的吸收，提高了檢測(cè)的靈敏度；同時(shí)，細(xì)化梯度洗脫條件，改善了雜質(zhì)檢出量和分離效果，測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確、真實(shí)體現(xiàn)產(chǎn)品純度。

按照建立的方法，考察自研制劑與原研樣品中聚合物雜質(zhì)含量，企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中增加聚合物檢查項(xiàng)的樣品，產(chǎn)品中雜質(zhì)檢出數(shù)量及含量均顯著降低，且批次間穩(wěn)定?？梢姡婵疾飚a(chǎn)品質(zhì)量，將質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與生產(chǎn)工藝緊密結(jié)合，準(zhǔn)確尋找關(guān)鍵質(zhì)量屬性，可及時(shí)排除風(fēng)險(xiǎn)，有效提高產(chǎn)品質(zhì)量，同時(shí)確保產(chǎn)品質(zhì)量的持續(xù)一致性。

目前，我國藥品消費(fèi)市場(chǎng)主體仍是仿制藥，通過質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)，促進(jìn)生產(chǎn)工藝調(diào)整、改進(jìn)，進(jìn)而提高藥品質(zhì)量［15］，對(duì)保證用藥安全性和質(zhì)量可控性都具有重要意義。