方云濤，蔡正清，邵卿

江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇 南京 210000

兩性霉素B 是一種大環(huán)內(nèi)酯乳糖多烯類抗生素，它主要作用機理是通過與真菌細胞膜上的麥角固醇相互結(jié)合，破壞真菌細胞膜的通透性，使得胞內(nèi)物質(zhì)如鉀離子、氨基酸、核苷酸等外漏，影響其正常代謝從而達到抑制真菌的生長和繁殖，對絕大部分真菌（如念珠菌、隱球菌、霉菌）均有很大的殺傷作用，抗菌療效很好，且很少有耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)，是臨床上用于治療侵入性真菌疾病的一線藥物［1-4］。兩性霉素B 脫氧膽酸鹽為兩性霉素B 傳統(tǒng)使用劑型，臨床應用最久，但是臨床應用中會出現(xiàn)腎臟損傷、肝臟損傷和靜脈注射不良反應，使其在臨床上的使用受到限制［5-6］。20 世紀90 年代出現(xiàn)了兩性霉素B 的新劑型——脂質(zhì)體兩性霉素B，與傳統(tǒng)使用劑型相比其顯示出巨大的優(yōu)勢，由于其包裹脂質(zhì)體通過增強對細胞膜麥角固醇的親和力，提高了兩性霉素B 的抗菌能力，還能通過控制和減慢兩性霉素在身體組織中的擴散速度，顯著降低由于兩性霉素B 的使用而引起的肝臟、腎臟的損傷和靜脈輸液產(chǎn)生的相關(guān)反應的發(fā)生率，使得兩性霉素的足量應用成為可能。目前對兩性霉素脂質(zhì)體的研究主要集中于兩性霉素B 脂質(zhì)體（Lipo-AB）的制備、藥效、對真菌感染引起疾病的療效及不良反應等方面，對其用藥安全性缺乏系統(tǒng)性的評價。因此，本研究從溶血性，過敏性及刺激性等方面開展試驗［7-9］，對其安全性評價進行補充，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

實驗兔4 只(普通級)，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場(合格證編號：0018790)；豚鼠（SPF級）24 只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證編號：0292746)；BALB/c 小鼠（SPF 級）24 只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證編號：0292746)。飼養(yǎng)于江蘇省藥物安全評價中心動物房中，且本研究實驗經(jīng)過江蘇省藥物研究所有限公司倫理委員會批準。

1.2 主要儀器與試劑

BS124S 電子天平（梅特勒-托利多），組織包埋機（天津愛華），RM2245 切片機（德國徠卡公司），ASP200 真空脫水機（德國徠卡公司），ST4040 染色機（德國徠卡公司），光學顯微鏡（奧林巴斯）。

兩性霉素B 脂質(zhì)體（Lipo-AB）（來源：江蘇省藥物安全評價中心供試品室，批號：040211040500，規(guī)格：50 mg/ 瓶）；陽性對照品卵白蛋白（egg almumin）（來源：SunShine，批號：0E200E20）；伊文思藍（來源：國藥集團化學試劑有限公司，批號：WC20091209）；5%葡萄糖注射液（來源：南京小營藥業(yè)集團有限公司，批號：2012042003，規(guī)格：100 mL∶5 g）。

2 方法

2.1 Lipo-AB 配置

臨床用法：取Lipo-AB 1 瓶（50 mg），用12 mL 無菌注射用水溶解，濃度為4 mg/mL，用5%葡萄糖注射液稀釋為濃度為2 mg/mL 的溶液，作為供試品。依據(jù)《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導原則》［7］要求，以下局部毒性試驗均采用的受試物濃度為2 mg/mL（臨床最大濃度）。

2.2 實驗方法

參照《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導原則》［7］進行血管刺激性實驗、體外溶血實驗、主動全身過敏和被動皮膚過敏實驗。

2.2.1 血管刺激性試驗普通級實驗兔3 只，左耳靜脈給予Lipo-AB，右耳給予等體積溶劑（5%葡萄糖注射液）作為對照，Lipo-AB 的使用劑量為10 mg/kg，為人用最大劑量的1.67 倍。給藥頻率：1 次/d，持續(xù)3 d；給藥容積為5 mL/kg；給藥速度為3 mL/min。每次給藥前后以及末次給藥后（24 h、48 h）觀察給藥部位的刺激性反應，末次給藥48 h后取注射部位（近心端血管）做組織病理學檢查。

2.2.2 體外溶血試驗成年實驗兔心臟采血10 mL，用玻璃珠去纖維蛋白，清洗，離心后，用葡萄糖注射液配置為2%混懸液備用。隨后取7 支試管，各個試管加樣如表1 所示，混勻，置于37 ℃恒溫箱中，在15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h 時間點觀察溶血現(xiàn)象。

表1 Lipo-AB溶血試驗加樣表 mL

2.2.3 主動全身過敏試驗豚鼠24 只，按體重隨機分組為高劑量組，低劑量組，陰性對照組和陽性對照組（卵白蛋白），每組各6 只。致敏階段，隔日腹腔給藥3 次，各組分別給予高劑量Lipo-AB（6.67 mg/kg），低劑量Lipo-AB（3.33 mg/kg），5%葡萄糖注射液和卵白蛋白（10 mg/mL），給藥容積為0.5 mL/300 g。末次致敏后第14 天，各組靜脈給予高劑量、低劑量、5%葡萄糖注射液及10 mg/mL 卵白蛋白2 mL/300 g 進行攻擊，給藥容積為2 mL/300 g。觀察過敏癥狀，參考表2、表3 進行結(jié)果判定。

表2 過敏反應癥狀

表3 全身致敏性評價標準

2.2.4 被動皮膚過敏試驗24 只BALB/C 小鼠分四組，高、低、陽性對照組、陰性對照組，每組6只，雌雄各半，分別腹腔給予高劑量Lipo-AB（20 mg/kg），低劑量Lipo-AB（6 mg/kg）、陽性對照品（卵白蛋白，5 mg/20g）與陰性對照（5%葡萄糖注射液），以2%氫氧化鋁凝膠為佐劑。給藥容積均為0.2 mL/20 g，隔日一次，共3 次。14 d 后取血制備抗血清。大鼠被動皮膚過敏試驗使用24 只SD 大鼠，雌雄各半，按體重分為4 組。背部脊柱兩側(cè)1.5 cm處各選取2 個點，間隔1.5 cm～2 cm，皮內(nèi)注射1∶2、1∶4、1∶8 和1∶16 的抗血清，0.1 mL/點，24 h后抗原激發(fā)，受試物組靜脈分別給予高劑量和等體積的0.5%伊文思藍混合液2 mL/200 g、低劑量和等體積0.5%伊文思藍混合液2 mL/200 g，陰性對照組給予5%葡萄糖注射液和等體積0.5%伊文思藍混合液2 mL/200 g；陽性對照組給予卵白蛋白和等體積0.5%伊文思藍混合液2 mL/200 g。30 min后取皮膚測定內(nèi)側(cè)藍斑直徑，判定實驗結(jié)果（直徑值大于5 mm 者結(jié)果為陽性）。

3 結(jié)果

3.1 血管刺激性試驗

實驗期間，各組動物肉眼觀察無異常，耳部血管也未發(fā)現(xiàn)刺激性癥狀，如紅斑、水腫等。與組織病理學檢查結(jié)果相一致，病理結(jié)果顯示各例兔耳各層組織正常，血管管壁完整無擴張和充血現(xiàn)象，血管內(nèi)皮細胞無腫脹、壞死、脫落，管腔內(nèi)無血栓，管周無水腫、出血和炎細胞浸潤（見圖1）。

圖1 Lipo-AB血管刺激實驗病理檢查（HE×200）：A.對照組T0401號血管近段；B.對照組T0401號血管中段；C.對照組T0401號血管遠段；D.給藥組T0403號血管近段；E.給藥組T0403號血管中段；F.給藥組T0401號血管遠段

3.2 體外溶血實驗

在2 mg/mL 濃度下，供試品Lipo-AB 溶血試驗結(jié)果為：在15 min 觀察點，1-6 號管凹液面處紅細胞下沉，可見一透明圓環(huán)，未見溶血現(xiàn)象，陽性對照管（7 號）呈透明紅色，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象；在30 min觀察到1-6 號管中紅細胞繼續(xù)下沉，未見溶血現(xiàn)象，陽性對照管溶血，試管底部未出現(xiàn)下沉紅細胞；在第45 分鐘、第1 小時、第2 小時、第3 小時觀察結(jié)果同30 min。3 h 觀察時間結(jié)束后拍照（結(jié)果見圖2），振搖試管，1 號到6 號管管底紅細胞均能均勻分散，均無紅細胞凝集現(xiàn)象。

3.3 主動全身過敏試驗

致敏期間，供試品高、低劑量組豚鼠體重下降，可能原因為腹腔注射抗菌素類藥物后，引起腸道正常菌群紊亂，導致豚鼠出現(xiàn)體重減輕，消瘦。各供試品組和陰性對照組激發(fā)后均未觀察到任何過敏癥狀，過敏反應結(jié)果為陰性；陽性對照組動物激發(fā)約5 s開始觀察到瘙癢、抽搐、大小便失禁等癥狀，所有動物在1 min 內(nèi)死亡，過敏反應評級為極強陽性，過敏反應發(fā)生率為100%。

3.4 被動皮膚過敏試驗

抗原激發(fā)30 min 處死動物，測定藍斑直徑，結(jié)果顯示：陰性對照、供試品低、高劑量結(jié)果均小于5 mm，結(jié)果為陰性。陽性對照組大鼠背部各個注射部位藍斑直徑均大于5 mm，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16 稀釋點藍斑直徑均值為17.2 mm、13.0 mm、11.8 mm、11.0 mm，被動皮膚過敏反應出現(xiàn)陽性反應的最大稀釋倍數(shù)為1∶16（結(jié)果見表4 和圖3）。

圖3 主動全身過敏試驗藍斑

表4 Lipo-AB大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（）mm

表4 Lipo-AB大鼠被動皮膚過敏試驗結(jié)果（）mm

4 討論

真菌感染通常是由于偶然接觸到真菌所致，若受感染患者免疫力低下，真菌即可在身體中存活、繁殖，隨即致病，對某些患者來說可能會危及生命。目前由于HIV 感染、化療、器官移植、免疫抑制劑等治療手段導致免疫力低下人群的增加，以及老齡患者比例增加等一些原因，使得侵襲性真菌感染成為臨床最常見的機會性感染疾病，對免疫力低下的重癥、老齡、兒科患者產(chǎn)生巨大威脅［10-11］。

兩性霉素B 作為一種多烯類廣譜抗生素，被廣泛應用于抗真菌感染，具有很高的臨床價值。兩性霉素是作用最強、抗菌譜最廣的抗真菌藥物之一，可以有效治療侵襲性念珠菌病、曲霉病、新生隱球菌病、毛霉病、組織胞漿菌病、馬爾尼菲籃狀菌病等深部真菌感染，并且其不通過P450 代謝，與其他藥物相互作用較少，不影響其他藥物的療效［12-13］。但是治療過程中會產(chǎn)生如低鉀血癥、肝腎功能受損、白細胞減少、心悸、低血壓、惡心嘔吐等副作用，限制了其在臨床上的使用［14-15］。此種情況促使Lipo-AB 這一劑型的出現(xiàn)，有研究顯示Lipo-AB穩(wěn)定的類脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)減少了其對紅細胞的溶解毒性，且體內(nèi)實驗也顯示出其相對于市售注射用制劑更好的耐受性［16］。同時也有多項研究證實應用Lipo-AB 對患者進行抗真菌治療，其腎毒性、輸液相關(guān)不良反應的發(fā)生率均低于普通注射制劑，并使得真菌感染患者獲得更好的治療效果［17-18］。

盡管Lipo-AB 在保留兩性霉素B 的有效抗真菌能力外，改善了與其相關(guān)的腎毒性等不良反應，但是Lipo-AB的抗真菌機制目前尚不完全明確，脂質(zhì)體藥物體內(nèi)結(jié)合釋放情況受什么因素影響，對不同真菌的藥物活性，可能產(chǎn)生的其他毒副反應、刺激性、過敏性和溶血性局部毒性及可逆性等等問題需要繼續(xù)研究明確。

本研究根據(jù)《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導原則》［7］以及《藥品注冊管理辦法》［8］的相關(guān)要求，采用了供試品Lipo-AB 臨床最大濃度（2 mg/mL）進行了刺激性、過敏性與溶血實驗，結(jié)果顯示：2 mg/mL Lipo-AB 對兔耳血管無刺激性作用；溶血試驗未見溶血或/和紅細胞凝集現(xiàn)象；在6.67 mg/kg 及3.33 mg/kg 劑量下，豚鼠全身主動過敏試驗結(jié)果為陰性；Lipo-AB 被動皮膚過敏反應結(jié)果均為陰性，提示在此濃度或劑量下，Lipo-AB 并未顯示出明顯的局部毒性，是安全的。