郭招娣，趙甜，許紅霞，郭鑫，趙小君，諶宗永，馬昂，劉宇晶，王明娟

北京陽光諾和藥物研究股份有限公司，北京 102200

阿齊沙坦（azilsartan）是新一代選擇性AT1 亞 型血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensin receptor blocker,ARBs）類抗高血壓藥，與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類降壓藥物相比，具有平穩(wěn)降壓及不會干咳的優(yōu)點(diǎn)［1-2］。基因毒性雜質(zhì)（genotoxic impurities）或致突變雜質(zhì)（mutagenic impurities)，指在較低水平時也有可能直接引起DNA 損傷，導(dǎo)致DNA 突變，從而可能引發(fā)癌癥的遺傳毒性雜質(zhì)，是影響用藥安全的關(guān)鍵風(fēng)險因素，需要重點(diǎn)關(guān)注［3-7］?；蚨倦s質(zhì)可能來源于原料藥合成工藝中的起始原料、工藝中間體、反應(yīng)副產(chǎn)物或溶劑、試劑、催化劑等［3］。根據(jù)本研究中使用的阿齊沙坦候選原料的合成路線，在步驟3 中使用了疊氮化鈉，而步驟4 中又使用了4-溴甲基-2'-氰基聯(lián)苯，有可能會與上一步驟中殘留的微量疊氮化鈉發(fā)生反應(yīng)，如圖1 所示，產(chǎn)生帶警示結(jié)構(gòu)的疊氮雜質(zhì)AMBC｛4'-(azidomethyl)［1,1-biphenyl］-2-cyanyl，4'-(疊氮甲基)［1,1-聯(lián)苯］-2-氰基｝，故需要對該雜質(zhì)的殘留風(fēng)險進(jìn)行評估。

圖1 阿齊沙坦合成路線中AMBC雜質(zhì)可能的產(chǎn)生途徑示意圖

疊氮化物通過抑制細(xì)胞色素C 氧化酶引起毒性效應(yīng)，會導(dǎo)致頭暈、低血壓、代謝性酸中毒、呼吸抑制等，甚至死亡［8-12］，因此非常有必要對藥品中疊氮化物的殘留水平進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控。本研究重點(diǎn)探討AMBC 雜質(zhì)殘留水平的監(jiān)控（疊氮化鈉與AMBC結(jié)構(gòu)差異較大，會采用另外一個系統(tǒng)監(jiān)控）：AMBC屬于帶疊氮化警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)、無致畸性報道、與藥物活性成分阿齊沙坦的結(jié)構(gòu)有較明顯差異，按照人用藥品注冊技術(shù)國際協(xié)調(diào)會議（ICH）M7 分類原則，應(yīng)歸屬為3 類基因毒性雜質(zhì)［3］；按照ICH M7指南控制策略，需要將該類雜質(zhì)的殘留水平控制在毒理學(xué)關(guān)注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）以下；按照最嚴(yán)苛的長期治療方案（使用時間>10 年）、終生患癌風(fēng)險為十萬分之一假設(shè)，AMBC 雜質(zhì)的TTC 值采用了1.5 μg/d，阿齊沙坦的每日最大用藥劑量為40 mg，故阿齊沙坦中AMBC 的限度設(shè)定為37.5 ppm（即：1.5 μg/d÷40 mg/d×1 000 μg/mg=37.5 ppm）。

在痕量疊氮化物雜質(zhì)的監(jiān)控中，常采用離子色譜法［8-12］；在提升痕量疊氮化物的檢測靈敏度方面，文獻(xiàn)中曾報道了柱切換在線基體消除法［11］、磁化陰離子交換金屬-有機(jī)骨架富集技 術(shù)（magnetized anion-exchange metal-organic frameworks）［12］、五氟芐基衍生-氣相色譜（GC-MS）法［13］等。本研究首次成功采用靈敏度、專屬性均很理想的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)［14-17］，對阿齊沙坦原料中的痕量AMBC 殘留風(fēng)險進(jìn)行了監(jiān)控，以保障新藥研發(fā)過程中所使用的阿齊沙坦原料及其制劑的用藥安全。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-MS/MS 質(zhì)譜儀（型號：API 4000，AB SCIEX公司）；超聲波清洗器（KH-600，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（AP225WD，日本島津公司）。

1.2 試藥、對照品和樣品

水（蒸餾水，屈臣氏）；乙腈（色譜純，MREDA 公司）；乙酸銨（色譜純，MREDA 公司）；雜質(zhì)AMBC 對照品（純度99.6%，STD 公司）；阿齊沙坦原料（批號：C1011-200501，C1011-200502，C1011-200503，浙江宏元藥業(yè)股份有限公司）；阿齊沙坦原料合成工藝步驟6 的工藝中間體C6 樣品（屬于目標(biāo)雜質(zhì)AMBC 產(chǎn)生后可能殘留的關(guān)鍵工藝中間體，批號：Y9117-200401，Y9117-200402，Y9117-200403，浙江宏元藥業(yè)股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件液相色譜：采用ACE Excel 3 C18 柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱溫為40 ℃；流動相A 為0.01 mol/L 乙酸銨溶液-乙腈（90∶10），流動相B 為乙腈，梯度洗脫：0～6.0 min,20%→90% B；6.0～11.0 min,90% B；11.01 min，90%→20% B 并維持至16 min，總流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL。

質(zhì)譜條件：采用API 4000 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，大氣壓化學(xué)電離-正離子掃描（APCI+），多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），探頭溫度：450 ℃，電暈針電流：3.0 μA，氣簾氣：35 psi，碰撞氣：4 psi，霧化氣：45 psi；用雜質(zhì)AMBC 的特征離子對207.3 →180.3 進(jìn)行定量監(jiān)測。

1.3.2 溶液配制（1）溶劑：采用80%乙腈。

（2）AMBC 對照品溶液：取AMBC 對照品約10 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加溶劑溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取100 μL 置于100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為AMBC 對照品溶液（約100 ng/mL，相當(dāng)于供試品溶液濃度的33.3 ppm）。

（3）供試品溶液：取樣品約30 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，混勻，即得（3 mg/mL）。

各溶液配制后，應(yīng)置于冷藏條件下保存。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性取“1.3.2”項(xiàng)下的空白溶劑、AMBC對照品溶液、供試品溶液，依次進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示：空白溶液與樣品基質(zhì)（阿齊沙坦的出峰時間約為7.3 min）均不會對目標(biāo)雜質(zhì)AMBC（保留時間約為9.3 min）的檢測造成干擾，且AMBC 的峰形較好，證明擬定方法的專屬性較好。

圖2 典型LC-MS/MS圖：A.空白溶劑；B.AMBC對照品溶液；C.樣品溶液

2.1.2 定量限與檢測限分別以信噪比（S/N）約為3 和10 作為AMBC 的檢測限（LOD）與定量限（LOQ）判定標(biāo)準(zhǔn)。取AMBC 對照品溶液，用溶劑進(jìn)行逐級稀釋，確定的檢測限（S/N 為6～7）約為0.062 ng/mL（相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.021 ppm），定量限（S/N 為12～16）約為0.21 ng/mL，相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.07 ppm，遠(yuǎn)低于AMBC 擬定限度（37.5 ppm），證明方法的檢測靈敏度非常理想。

取定量限濃度水平的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣，AMBC 峰面積的RSD 為2.8%（n=6），證明方法在定量限水平時的進(jìn)樣精密度較好。

2.1.3 進(jìn)樣精密度取“1.3.2”項(xiàng)下的AMBC 對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 針，AMBC 保留時間和峰面積的RSD 分別為0.1%和1.6%，證明方法的進(jìn)樣精密度較好。

2.1.4 重復(fù)性平行配制6 份100%限度水平的加標(biāo)供試品溶液考察方法的重復(fù)性，結(jié)果表明：6 份樣品中AMBC 雜質(zhì)含量測定結(jié)果RSD 為1.5%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 線性關(guān)系考察分別配制相當(dāng)于“1.3.2”項(xiàng)下AMBC 對照品溶液濃度（100 ng/mL）10%、50%、100%、150%、200%和300%的溶液（實(shí)際濃度介于10.4～312.2 ng/mL 范圍，相當(dāng)于3.5～104.1 ppm），用“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件考察方法的線性響應(yīng)情況，結(jié)果表明：在能夠覆蓋擬定限度水平（37.5 ppm）的上述濃度范圍內(nèi)，雜質(zhì)AMBC 的峰面積（Y）與溶液濃度（X）呈良好的線性響應(yīng)，線性回歸方程為Y=7 002X+16 571，r=0.999 8 。

2.1.6 準(zhǔn)確度在雜質(zhì)AMBC 限度（100 ng/mL）的50%、100%、150%三種添加水平下進(jìn)行擬定LCMS/MS 方法的準(zhǔn)確度考察，每種濃度水平分別平行配制三份溶液，加樣回收率結(jié)果如表1 所示：9 份加標(biāo)樣品中，雜質(zhì)AMBC 的加樣回收率介于100.2%～104.2%，均在規(guī)定范圍內(nèi)［18］，證明樣品溶液的前處理適宜、樣品基質(zhì)不會干擾目標(biāo)雜質(zhì)AMBC 的準(zhǔn)確測定。

表1 用擬定方法測得的AMBC雜質(zhì)的加樣回收率結(jié)果

2.1.7 溶液穩(wěn)定性將對照品溶液、100%加標(biāo)供試品溶液在10 ℃條件下放置，分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析，結(jié)果表明：上述2種溶液在12 h之內(nèi)，雜質(zhì)AMBC 峰面積的RSD%分別為1.79%和1.71%，說明兩種溶液在10 ℃條件下，至少12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 樣品分析

利用上述經(jīng)過驗(yàn)證的串聯(lián)質(zhì)譜方法對3 批阿齊沙坦原料進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果見表2。3 批樣品中均未檢測出AMBC 雜質(zhì)（<0.021 ppm），說明采用擬定合成和純化工藝能夠有效避免阿齊沙坦原料中AMBC 的殘留風(fēng)險。

表2 阿齊沙坦原料中AMBC的殘留量檢測結(jié)果 ppm

采用該方法，對3 批工藝中間體（步驟6）樣品（批號：Y9117-200401，Y9117-200402，Y9117-200403）也進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明：這些工藝中間體中AMBC 殘留水平均低于檢測限（<0.021 ppm），進(jìn)一步驗(yàn)證了候選阿齊沙坦原料采用的合成和純化工藝能夠有效避免殘留疊氮化雜質(zhì)AMBC。

3 討論

AMBC 雜質(zhì)屬于殘留風(fēng)險較大的工藝副產(chǎn)物，帶疊氮化警示結(jié)構(gòu)，殘留水平要求非?？量蹋什捎昧遂`敏度較高的液相-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了方法開發(fā)。在方法建立階段，對AMBC 雜質(zhì)的定量離子和定性離子進(jìn)行了篩選，并且針對性優(yōu)化了離子源參數(shù)及碰撞電壓，優(yōu)化后的LC-MS/MS 法的最低檢測限（0.021 ppm）甚至低于限度要求（37.5 ppm）的千分之一，能夠充分滿足方法的檢測靈敏度要求，而且方法的準(zhǔn)確度、線性、專屬性、重復(fù)性也均很理想，能較好地滿足阿齊沙坦原料及其工藝中間體中痕量AMBC 的殘留風(fēng)險評估。另外，需要注意的是：目標(biāo)雜質(zhì)AMBC 在溶液狀態(tài)下，如果在室溫條件下進(jìn)樣，穩(wěn)定性會受到影響；若將進(jìn)樣溫度設(shè)定在10 ℃，其溶液的穩(wěn)定性在12 h 之內(nèi)有保障，故建議各溶液配制后置于冷藏條件下保存。

目前，尚未查詢到阿齊沙坦中AMBC 雜質(zhì)的檢測方法報道。本方法的建立將為具有類似警示結(jié)構(gòu)的疊氮類雜質(zhì)的殘留風(fēng)險監(jiān)控提供很好的借鑒。

4 結(jié)論

本研究采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，首次建立了能夠用于阿齊沙坦原料中帶疊氮化合物警示結(jié)構(gòu)的AMBC雜質(zhì)殘留量檢測的方法，所建的方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，在能夠覆蓋限度水平的較寬濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，方法的進(jìn)樣精密度、重復(fù)性均很理想，能夠較好地滿足阿齊沙坦原料中痕量AMBC 雜質(zhì)的殘留量檢測需求，有效地保障了阿齊沙坦原料及其制劑的用藥安全。