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        基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術(shù)的血平片化學(xué)成分及指紋圖譜的研究

        2023-11-03 03:49:58梁國(guó)嬪周朝忠康興東李晶夏淑英李小鋒
        藥品評(píng)價(jià) 2023年7期
        關(guān)鍵詞:平片黃素皂苷

        梁國(guó)嬪,周朝忠,康興東,李晶,夏淑英,李小鋒

        1.江西省藥品檢查員中心,江西 南昌 330029;2.江西普正制藥股份有限公司,江西 吉安 343100

        血平片處方中包括地黃、三七、海螵蛸、熟大黃、茜草、地榆和炒蒲黃等藥材,具有清熱化瘀、止血調(diào)經(jīng)的功效。血平片在臨床上常用于治療因挾瘀所致的崩漏[1]。目前血平片的質(zhì)量控制主要以大黃和三七的含量測(cè)定為主,缺少對(duì)血平片整體的質(zhì)量控制[2]。中藥及其制劑成分極其復(fù)雜且多樣,對(duì)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)難度也較大。目前超高效液相色譜-四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)技術(shù)在中藥的化學(xué)成分分析方面有著快速、高效等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究,而中藥指紋圖譜技術(shù)可在中藥化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上提供豐富的信息,進(jìn)而整體地評(píng)價(jià)中藥制劑的質(zhì)量[3-5]。

        血平片處方中的三七含有的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1[6-7]以及地榆中含有的地榆皂苷-Ⅱ[8]等成分多為紫外末端吸收的成分,僅使用紫外檢測(cè)器無(wú)法檢測(cè)出這些成分。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器廣泛用于無(wú)紫外吸收或末端吸收的有機(jī)物質(zhì),如人參皂苷、黃芪甲苷等,是一種通用型檢測(cè)器。因此本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術(shù)和對(duì)照品比對(duì)鑒定血平片主要成分的基礎(chǔ)上,采用高效液相色譜法聯(lián)合紫外檢測(cè)器(HPLC-UV)與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)建立方便可行的指紋圖譜方法,為血平片的質(zhì)量控制提供客觀有效的評(píng)價(jià)方法。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        Waters 2695-2996-ELSD 液相色譜儀(美國(guó)Waters 公 司);Ultimate 3000 超 高效液相色譜系統(tǒng)-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液質(zhì)聯(lián)用譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司);島津LC20A-ELSD 液相色譜儀(日本島津公司);BSA124S-CW 電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];9960D 超聲波清洗儀(CBL 科貝爾);Mili-Q 超純水儀(美國(guó)Millipore 公司)。

        1.2 材料

        毛蕊花糖苷、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、地榆皂苷-Ⅱ、香蒲新苷對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào)分別為111530-201914、110756-201913、110795-201710、110757-201607、110796-201922、110758-201817、110745-201921、110703-201933、110704-202028、111952-201301、111573-201806);13 批血平片樣品均由江西普正制藥股份有限公司生產(chǎn)和提供;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;水為自制超純水。

        2 方法

        2.1 對(duì)照品溶液的制備

        分別稱取大黃素、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、大黃酸、人參皂苷Rb1、大黃酚、地榆皂苷-Ⅱ、大黃素甲醚、香蒲新苷適量,置25 mL 量瓶中,加甲醇溶解后定容至刻度,搖勻,微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

        2.2 供試品溶液的制備

        取血平片20 片,除去薄膜衣,精密稱定,研細(xì),取粉末約2 g,精密稱定,精密加入70%甲醇25 mL,稱定重量,加熱回流2 h,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

        2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

        2.3.1 色譜條件采用XBridge BEH C18 色譜柱(2.1 mm×150 mm,2.5 μm),以0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~20 min,5%→95%B;20~45 min,95%B;45~60 min,95%→5%B),流速0.3 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量5 μL。

        2.3.2 質(zhì)譜條件使用賽默飛HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行樣品檢測(cè)。儀器校正后誤差<5 ppm,電噴霧離子源采用正、負(fù)離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。以普通氮?dú)鉃檩o助氣和鞘氣,高純氮為碰撞氣。采用Full MS/dd-MS2(Top3)正負(fù)切換同時(shí)采集,觸發(fā)前三強(qiáng)母離子的二級(jí)掃描,碰撞能量NCE 設(shè)置為:20、40、60;掃描范圍:150~1 500;裂解電壓:3.2 kV;鞘氣:40 psi;輔助氣流量:10 arb ;離子傳輸管溫度:320 ℃;一級(jí)質(zhì)譜分辨率:70 000FWHM ;二級(jí)質(zhì)譜分辨率:17 500FWHM。數(shù)據(jù)采集軟件采用Xcalibur2.1。

        2.4 指紋圖譜色譜條件

        采用ODS C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);以0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0~5 min,20% B;5~45 min,20%→48%B ;45~60 min,48% →61% B ;60~90 min,61%→98% B);柱溫30 ℃;流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;ELSD 溫度60 ℃;氮?dú)鈮毫?50 kPa;增益值6/32 倍。

        3 結(jié)果

        3.1 血平片的主要成分分析

        在擬定的分析條件下,血平片在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖1。根據(jù)得到的高分辨質(zhì)譜提供的一級(jí)準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰的精確m/z 信息,確證了有關(guān)物質(zhì)及特征碎片的化合物結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)已有的數(shù)據(jù)庫(kù)和對(duì)照品的相關(guān)的文獻(xiàn)[6-18]資料,共鑒定或推斷41 種主要化學(xué)成分,鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。初步闡明了血平片的物質(zhì)基礎(chǔ)信息,為建立信息量豐富的血平片指紋圖譜提供便利。

        圖2 13批血平片HPLC指紋圖譜共有模式(UV 254 nm)

        表1 血平片中主要化學(xué)成分鑒定

        3.2 指紋圖譜的建立與分析

        3.2.1 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)取13 批次血平片樣品,按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,將所得圖譜導(dǎo)入“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行計(jì)算,得到13 批樣品的相似度值,見(jiàn)表2。樣品相似度范圍為0.903~0.990,說(shuō)明13 批血平片的批間質(zhì)量穩(wěn)定性良好。13 批樣品HPLC 指紋圖譜共有模式圖見(jiàn)2、圖3,生成的對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖4、圖5。

        圖4 血平片對(duì)照指紋圖譜(UV 254 nm)

        圖5 血平片對(duì)照指紋圖譜(UV 254 nm)

        表2 不同批次血平片HPLC指紋圖譜相似度

        3.2.2 精密度試驗(yàn)按“2.2”項(xiàng)下方法制備血平片(批號(hào)150902)供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次,將所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”(以下簡(jiǎn)稱“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”),結(jié)果其相似度均在0.98 以上。并且在UV、ELSD 條件下分別以17、23 號(hào)特征峰為參照峰,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值分別為0.11%、0.17%,相對(duì)峰面積RSD 值分別為1.83%、1.20 %,表明該方法精密度良好。

        3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份血平片(批號(hào)150902)供試品溶液,分別測(cè)定,將所得圖譜導(dǎo)入“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”,結(jié)果相似度均在0.95以上。在UV、ELSD 條件下以17、23 號(hào)特征峰為參照峰,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 值分別為1.18%、0.10%,相對(duì)峰面積RSD 值分別為1.66%、0.38%,表明該方法重復(fù)性良好。

        3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“3.2.1”項(xiàng)下供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定,將所得圖譜導(dǎo)入“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”,結(jié)果相似度均在0.98 以上。在UV、ELSD 條件下以17、23 號(hào)特征峰為參照峰,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 值分別為0.13%、0.08%,相對(duì)峰面積RSD 值分別為2.14%、0.81%,表明該供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        4 討論

        本研究首次采用 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術(shù)對(duì)血平片的化學(xué)成分定性分析,基于分析結(jié)果對(duì)指紋圖譜起到了指導(dǎo)作用。指紋圖譜同時(shí)采用HPLC-UV 和HPLC-ELSD 全面對(duì)血平片特征峰信息表征,從整體性方面體現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[3]。該技術(shù)具有快速、高效地對(duì)中藥的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析的優(yōu)勢(shì),指紋圖譜能夠全面地反映中藥的整體質(zhì)量。采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合指紋圖譜技術(shù)對(duì)血平片的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究,與現(xiàn)有的血平片等含三七制劑的質(zhì)量控制方法[1-2]相比,能顯示更多的特征峰信息,能有效地表征其質(zhì)量,也為血平片后續(xù)的質(zhì)量控制與藥效研究提供了物質(zhì)信息基礎(chǔ)。

        在血平片指紋圖譜的建立方面考察了提取溶劑、提取方式等因素,篩選出最佳制備方法,最終采用以70%甲醇加熱回流2 h 的提取方法。

        本研究建立的指紋圖譜進(jìn)行了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn),確定了方法的可行性;通過(guò)對(duì)共有峰的確認(rèn)與各藥材相關(guān)聯(lián),方便對(duì)處方中大部分藥材進(jìn)行鑒別,但其中海螵蛸中的成分信息在血平片中展現(xiàn)較少,可能是因?yàn)槲镔|(zhì)特性、提取方式等原因?qū)е隆?/p>

        本研究應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術(shù)對(duì)血平片的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定,對(duì)血平片藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了重要依據(jù),但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

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