梁國(guó)嬪，周朝忠，康興東，李晶，夏淑英，李小鋒

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；2.江西普正制藥股份有限公司，江西 吉安 343100

血平片處方中包括地黃、三七、海螵蛸、熟大黃、茜草、地榆和炒蒲黃等藥材，具有清熱化瘀、止血調(diào)經(jīng)的功效。血平片在臨床上常用于治療因挾瘀所致的崩漏［1］。目前血平片的質(zhì)量控制主要以大黃和三七的含量測(cè)定為主，缺少對(duì)血平片整體的質(zhì)量控制［2］。中藥及其制劑成分極其復(fù)雜且多樣，對(duì)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)難度也較大。目前超高效液相色譜-四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS）技術(shù)在中藥的化學(xué)成分分析方面有著快速、高效等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，而中藥指紋圖譜技術(shù)可在中藥化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上提供豐富的信息，進(jìn)而整體地評(píng)價(jià)中藥制劑的質(zhì)量［3-5］。

血平片處方中的三七含有的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1［6-7］以及地榆中含有的地榆皂苷-Ⅱ［8］等成分多為紫外末端吸收的成分，僅使用紫外檢測(cè)器無(wú)法檢測(cè)出這些成分。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器廣泛用于無(wú)紫外吸收或末端吸收的有機(jī)物質(zhì)，如人參皂苷、黃芪甲苷等，是一種通用型檢測(cè)器。因此本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術(shù)和對(duì)照品比對(duì)鑒定血平片主要成分的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法聯(lián)合紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）建立方便可行的指紋圖譜方法，為血平片的質(zhì)量控制提供客觀有效的評(píng)價(jià)方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695-2996-ELSD 液相色譜儀（美國(guó)Waters 公 司）；Ultimate 3000 超 高效液相色譜系統(tǒng)-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液質(zhì)聯(lián)用譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；島津LC20A-ELSD 液相色譜儀（日本島津公司）；BSA124S-CW 電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；9960D 超聲波清洗儀（CBL 科貝爾）；Mili-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 材料

毛蕊花糖苷、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、地榆皂苷-Ⅱ、香蒲新苷對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)分別為111530-201914、110756-201913、110795-201710、110757-201607、110796-201922、110758-201817、110745-201921、110703-201933、110704-202028、111952-201301、111573-201806）；13 批血平片樣品均由江西普正制藥股份有限公司生產(chǎn)和提供；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；水為自制超純水。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取大黃素、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、大黃酸、人參皂苷Rb1、大黃酚、地榆皂苷-Ⅱ、大黃素甲醚、香蒲新苷適量，置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取血平片20 片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，取粉末約2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用條件

2.3.1 色譜條件采用XBridge BEH C18 色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.5 μm），以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～20 min，5%→95%B；20～45 min，95%B；45～60 min，95%→5%B），流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件使用賽默飛HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行樣品檢測(cè)。儀器校正后誤差<5 ppm，電噴霧離子源采用正、負(fù)離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。以普通氮?dú)鉃檩o助氣和鞘氣，高純氮為碰撞氣。采用Full MS/dd-MS2（Top3）正負(fù)切換同時(shí)采集，觸發(fā)前三強(qiáng)母離子的二級(jí)掃描，碰撞能量NCE 設(shè)置為：20、40、60；掃描范圍：150～1 500；裂解電壓：3.2 kV；鞘氣：40 psi；輔助氣流量：10 arb ；離子傳輸管溫度：320 ℃；一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000FWHM ；二級(jí)質(zhì)譜分辨率：17 500FWHM。數(shù)據(jù)采集軟件采用Xcalibur2.1。

2.4 指紋圖譜色譜條件

采用ODS C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～5 min，20% B；5～45 min，20%→48%B ；45～60 min，48% →61% B ；60～90 min，61%→98% B）；柱溫30 ℃；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；ELSD 溫度60 ℃；氮?dú)鈮毫?50 kPa；增益值6/32 倍。

3 結(jié)果

3.1 血平片的主要成分分析

在擬定的分析條件下，血平片在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖1。根據(jù)得到的高分辨質(zhì)譜提供的一級(jí)準(zhǔn)分子離子峰和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子峰的精確m/z 信息，確證了有關(guān)物質(zhì)及特征碎片的化合物結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)已有的數(shù)據(jù)庫(kù)和對(duì)照品的相關(guān)的文獻(xiàn)［6-18］資料，共鑒定或推斷41 種主要化學(xué)成分，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。初步闡明了血平片的物質(zhì)基礎(chǔ)信息，為建立信息量豐富的血平片指紋圖譜提供便利。

圖2 13批血平片HPLC指紋圖譜共有模式（UV 254 nm）

表1 血平片中主要化學(xué)成分鑒定

3.2 指紋圖譜的建立與分析

3.2.1 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)取13 批次血平片樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，將所得圖譜導(dǎo)入“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”進(jìn)行計(jì)算，得到13 批樣品的相似度值，見(jiàn)表2。樣品相似度范圍為0.903～0.990，說(shuō)明13 批血平片的批間質(zhì)量穩(wěn)定性良好。13 批樣品HPLC 指紋圖譜共有模式圖見(jiàn)2、圖3，生成的對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 血平片對(duì)照指紋圖譜（UV 254 nm）

圖5 血平片對(duì)照指紋圖譜（UV 254 nm）

表2 不同批次血平片HPLC指紋圖譜相似度

3.2.2 精密度試驗(yàn)按“2.2”項(xiàng)下方法制備血平片（批號(hào)150902）供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，將所得圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”（以下簡(jiǎn)稱“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”），結(jié)果其相似度均在0.98 以上。并且在UV、ELSD 條件下分別以17、23 號(hào)特征峰為參照峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值分別為0.11%、0.17%，相對(duì)峰面積RSD 值分別為1.83%、1.20 %，表明該方法精密度良好。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份血平片（批號(hào)150902）供試品溶液，分別測(cè)定，將所得圖譜導(dǎo)入“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，結(jié)果相似度均在0.95以上。在UV、ELSD 條件下以17、23 號(hào)特征峰為參照峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 值分別為1.18%、0.10%，相對(duì)峰面積RSD 值分別為1.66%、0.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取“3.2.1”項(xiàng)下供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定，將所得圖譜導(dǎo)入“評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，結(jié)果相似度均在0.98 以上。在UV、ELSD 條件下以17、23 號(hào)特征峰為參照峰，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 值分別為0.13%、0.08%，相對(duì)峰面積RSD 值分別為2.14%、0.81%，表明該供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

4 討論

本研究首次采用 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術(shù)對(duì)血平片的化學(xué)成分定性分析，基于分析結(jié)果對(duì)指紋圖譜起到了指導(dǎo)作用。指紋圖譜同時(shí)采用HPLC-UV 和HPLC-ELSD 全面對(duì)血平片特征峰信息表征，從整體性方面體現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［3］。該技術(shù)具有快速、高效地對(duì)中藥的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析的優(yōu)勢(shì)，指紋圖譜能夠全面地反映中藥的整體質(zhì)量。采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合指紋圖譜技術(shù)對(duì)血平片的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究，與現(xiàn)有的血平片等含三七制劑的質(zhì)量控制方法［1-2］相比，能顯示更多的特征峰信息，能有效地表征其質(zhì)量，也為血平片后續(xù)的質(zhì)量控制與藥效研究提供了物質(zhì)信息基礎(chǔ)。

在血平片指紋圖譜的建立方面考察了提取溶劑、提取方式等因素，篩選出最佳制備方法，最終采用以70%甲醇加熱回流2 h 的提取方法。

本研究建立的指紋圖譜進(jìn)行了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)，確定了方法的可行性；通過(guò)對(duì)共有峰的確認(rèn)與各藥材相關(guān)聯(lián)，方便對(duì)處方中大部分藥材進(jìn)行鑒別，但其中海螵蛸中的成分信息在血平片中展現(xiàn)較少，可能是因?yàn)槲镔|(zhì)特性、提取方式等原因?qū)е隆?/p>

本研究應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技術(shù)對(duì)血平片的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，對(duì)血平片藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了重要依據(jù)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。