胡美英，余中霞，張繼紅，黃道明

上饒市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證院藥品檢測(cè)分院，江西 上饒 334000

金櫻葉在我國(guó)西南、中南、華東等地區(qū)均有分布，系薔薇科植物金櫻的嫩葉［1］，具有清熱解毒、活血止血之功效，主治金瘡、潰瘍、燙火傷、閉經(jīng)等，也常用于治療燒燙傷及外傷性出血，是古方“軍中一捻金”的主要藥味之一［2］。研究［3-6］顯示，金櫻葉中含有黃酮、三萜、酚酸、皂苷等多類(lèi)化合物，具有抗炎消腫、抗腫瘤、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)等多種作用［7］，是民間常用一味中藥。

中藥在治療和預(yù)防疾病上發(fā)揮著重要作用。我國(guó)中藥資源種類(lèi)繁多、分布廣泛、產(chǎn)量豐富，但很多中藥非常用部位在生產(chǎn)加工過(guò)程中被丟棄，資源未得到充分使用，產(chǎn)出與藥用失衡。金櫻葉資源豐富，藥用歷史悠久，療效確切可靠，所含的黃酮類(lèi)成分具有顯著的抗腫瘤、抗炎活性［8］，但在收集時(shí)往往被扔掉，未得到充分利用，深入研究金櫻葉意義重大。本試驗(yàn)以金櫻葉為研究對(duì)象，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)金櫻葉總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用HPLC 法對(duì)金櫻葉中蘆丁和槲皮素的含量進(jìn)行測(cè)定，以期為金櫻葉資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；UV5500 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。對(duì)照品蘆?。ㄅ?hào)111081-201202，純度99.2%）以及槲皮素（批號(hào)100081-201608，純度99.6%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。金櫻葉采自江西醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校植物園，經(jīng)上饒市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證院藥品檢測(cè)分院黃道明副主任藥師鑒定為薔薇科植物金櫻Rosa laevigataMichx.的嫩葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 金櫻葉中總黃酮的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取蘆丁適量，制得濃度為0.1 mg/mL 的對(duì)照溶液。參照文獻(xiàn)［9］方法，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，得回歸方程為A=9.763C+0.032（r=0.999 8）。

2.1.2 樣品含量的測(cè)定精密稱取金櫻葉粉末1.0 g，按一定的方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下測(cè)定其吸光度值，計(jì)算其總黃酮含量?？傸S酮得率=（Y-0.032）×10×V×100/（9.763×m×1 000）。式中：Y為吸光度值；10 為稀釋倍數(shù)；V 為提取液體積；m 為樣品質(zhì)量。

2.1.3 單因素考察以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%），超聲時(shí)間（30、45、60、75、90 min），提取溫度（50、60、70、80、90 ℃），液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知，在以50%乙醇、超聲60 min、提取溫度70 ℃、液料比25∶1 的條件下總黃酮提取效果最佳。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果：A.乙醇溶度；B.超聲時(shí)間；C.提取溫度；D.液料比

2.1.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、超聲時(shí)間、提取溫度、液料比4 個(gè)因素為總黃酮提取影響的考察因素，設(shè)計(jì)總黃酮提取條件，設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表1 和表2。

表1 響應(yīng)面法(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

2.1.5 方差分析金櫻葉總黃酮的提取率對(duì)4 個(gè)考察因素的回歸方程為：Y=8.82+0.67A+0.39B+0.61 C+0.40D+0.11AB-0.39AC-0.41AD-0.25BC-0.22BD-0.30CD-0.85A2-0.88B2-1.03C2-0.51D2。結(jié)果顯示，在設(shè)定的區(qū)域內(nèi)，所建立的模型達(dá)到極顯著水平（P<0.01），其中二次項(xiàng)中A、C、A2、B2、C2的P值均達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），表明方程擬合較好。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析結(jié)果

2.1.6 響應(yīng)面分析通過(guò)Design-Expert 9.0.4 軟件繪制考察指標(biāo)與自變量之間的等高線圖，具體見(jiàn)圖2。結(jié)果所得最佳提取工藝為：乙醇濃度53.2%、超聲時(shí)間62.95 min、提取溫度71.8 ℃、料液比25.8∶1，此條件下總黃酮得率為9.06%。

圖2 不同因素間的響應(yīng)曲面圖

2.1.7 驗(yàn)證試驗(yàn)考慮實(shí)際操作可行性，將預(yù)測(cè)到的條件修正為：乙醇濃度53%、超聲時(shí)間63 min、提取溫度72℃、料液比25∶1，此條件下總黃酮得率為9.03%，與預(yù)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明方程與實(shí)際情況擬合良好，提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.2 金櫻葉中蘆丁和槲皮素的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備取蘆丁、槲皮素對(duì)照品適量，置100 mL 量瓶中，加80%甲醇溶解，定容，搖勻，得濃度分別為316.5、88.2 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備精密稱取干燥后的金櫻葉粉末1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入10 mL80%甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜柱：Agilent Extend C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），采用梯度洗脫（0～20 min，10%→28%A；20～45 min，28%→60%A），檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。分別取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，HPLC圖如圖3所示，各成分分離度較好。

圖3 液相色譜圖：A.對(duì)照品；B.金櫻葉供試品

2.2.4 線性關(guān)系精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，置10 mL 量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度。分別吸取10 μL 注入液相色譜儀測(cè)定，以濃度X 為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸方程和線性關(guān)系

2.2.5 精密度試驗(yàn)取同一份供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測(cè)定6 次。結(jié)果蘆丁和槲皮素的峰面積RSD 分別為1.52%、1.98%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12、24 h 進(jìn)樣分析。結(jié)果蘆丁和槲皮素的峰面積RSD 分別為1.46%、1.65%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)取干燥后的金櫻葉粉末6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果蘆丁和槲皮素含量的RSD 分別為1.02%、2.36%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn)取干燥后的金櫻葉粉末6 份，每份約0.5 g，精密稱定，加入適量的蘆丁和槲皮素對(duì)照品，測(cè)定含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5，表明建立的方法準(zhǔn)確可靠。

表5 加樣回收率測(cè)試結(jié)果

2.2.9 含量測(cè)定按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備3 份金櫻葉供試品溶液，吸取10 μL 注入液相色譜儀測(cè)定含量，測(cè)得蘆丁含量為1.168 mg/g，槲皮素含量為0.062 mg/g。

3 討論

目前，對(duì)于中藥有效成分的提取工藝優(yōu)化，主要有正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法。正交法只是試驗(yàn)所用水平的某一種組合，結(jié)果具有局限性。響應(yīng)面法可對(duì)系列數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合，能直觀地分析出各個(gè)因素之間交互關(guān)系，所得結(jié)果更精確，已廣泛用于有效成分的提取工藝優(yōu)化［11］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)選了金櫻葉總黃酮提取工藝，所得金櫻葉總黃酮提取率為9.03%，比正交法優(yōu)化的條件所得的8.67%提取率更優(yōu)。此外，對(duì)于金櫻葉的研究，目前主要集中在化學(xué)成分和藥理作用方面，對(duì)其質(zhì)量控制和有效成分的含量測(cè)定研究還未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)建立了金櫻葉中蘆丁和槲皮素2 個(gè)黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定方法，所建立的方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性高、穩(wěn)定性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可為后續(xù)金櫻葉的資源利用、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、質(zhì)量控制等研究提供依據(jù)。