李林峻，劉國翔，劉張馳，王炎，張瑋，王娟，2*（.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)重點實驗室，廣西 桂林 5499；2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 5499）

莪術(shù)醇為姜科植物莪術(shù)中的特征性成分[1]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實莪術(shù)醇對多種癌癥具有抑制作用[2]，例如卵巢癌[3]、結(jié)直腸癌[4]、鼻咽癌[5]、胃癌[6]和乳腺癌[7]等，這表明莪術(shù)醇在癌癥治療中具有巨大潛力。一方面，莪術(shù)醇作為倍半萜類化合物[1]，在水中的溶解率低[8]，這導(dǎo)致其存在吸收不完全或生物利用度差等問題，從而限制了莪術(shù)醇的臨床應(yīng)用；另一方面，雖然目前有含莪術(shù)成分的中成藥上市，但針對莪術(shù)醇單體，尚無相關(guān)劑型上市。因此開發(fā)莪術(shù)醇新劑型，對推進莪術(shù)醇的臨床應(yīng)用及相關(guān)研究具有重要意義。針對以上問題，目前已有研究將莪術(shù)醇制備成脂質(zhì)體[9]、固體分散體[10]、納米混懸劑[11]等劑型，但尚未見將莪術(shù)醇制備為片劑的相關(guān)報道。

片劑是由藥物成分和相關(guān)輔料混合均勻后壓合而成的片狀劑型，是活性藥物成分成藥的首選和最常用的藥物劑型。相較于其他藥物劑型，例如脂質(zhì)體、固體分散體等，片劑具有制備簡單、成本低和便于攜帶等優(yōu)點[12]，并且制劑所用的親水性高分子輔料在胃液中形成膠體使藥物較為均勻地分散在胃液中[13]，一定程度上解決了莪術(shù)醇吸收不完全或生物利用度差的問題。本課題組通過濕法制粒壓片法將莪術(shù)醇制備成片劑劑型，通過對莪術(shù)醇片劑性能和體外累計溶出的考察以及大鼠在體腸循環(huán)的實驗，初步建立莪術(shù)醇片劑的制備工藝并探索了其在大鼠小腸中的吸收速率，以期為莪術(shù)醇片劑向工業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相Waters e2695（沃特世科技有限公司）；YC-5單沖壓片機（廣州金本機械設(shè)備有限公司）；片劑四用測定儀、智能藥物溶出度儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；NanoQuant酶標(biāo)儀（瑞士帝肯）；pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；千分之一電子天平（島津企業(yè)管理有限公司）；RO反滲透凈水器（臺灣力宵泵業(yè)有限公司）；超純水機（廣西南寧市博美生物科技有限公司）。

1.2 試藥

莪術(shù)醇（純度：99%，自制）；一水合乳糖（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；玉米淀粉、羥丙基甲基纖維素、滑石粉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚維酮、硬脂酸鎂（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；鹽酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司）；乙酸鈉（成都市科龍化工試劑廠）；十二烷基硫酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；乙腈（安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

1.3 動物

SPF級SD大鼠6只，雄性，體重（200±20）g [湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2019-0004，動物使用證號：SYXK（桂）2020-0005]。

2 方法與結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇片劑體外累計溶出度分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為ODS柱（Atlantis d C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈（30∶70）；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。

2.1.2 方法學(xué)考察 精密稱取莪術(shù)醇對照品20 mg，于1 mL無水乙醇中溶解得到20 mg·mL-1的莪術(shù)醇對照品母液，精密吸取0、0.625、1.25、2.5和5 μL的莪術(shù)醇對照品溶液于1 mL無水乙醇中混勻，得到質(zhì)量溶度分別為0、0.125、0.025、0.05和0.1 mg·mL-1的對照品溶液。以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程A＝1.756×104C+1.178×104（R2＝0.9989），莪術(shù)醇在0～0.1 mg·mL-1時與峰面積線性關(guān)系良好；供試品中其他成分對目標(biāo)峰沒有干擾，見圖1。說明該方法專屬性良好；平行配制6份對照品溶液進行重復(fù)性測試，RSD＝0.85%，表明該方法重復(fù)性較好。

圖1 莪術(shù)醇體外溶出的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatography of in vitro dissolution of curcumol

2.2 莪術(shù)醇XRD分析

取莪術(shù)醇對照品研磨后進行XRD分析，檢測條件為步長0.02°，掃描范圍5°～90°，電壓40 kV，電流40 mA。結(jié)果顯示，本實驗室純化的莪術(shù)醇在8.238°、14.280°、16.516°和21.897°處有較為明顯的衍射峰，說明其以晶體形式存在，后續(xù)實驗都使用該晶型的莪術(shù)醇。

2.3 莪術(shù)醇粒徑分析

使用研缽對莪術(shù)醇晶體進行研磨，采用篩分法對莪術(shù)醇的粒徑進行分析，選擇孔徑分別為25、45、75、88和125 μm的篩網(wǎng)，按照孔徑從小到大依次摞起，最下面為篩底，手動震動若干小時后，記錄每層篩網(wǎng)中莪術(shù)醇粉末的質(zhì)量，并由此求得莪術(shù)醇粒徑的累計分布函數(shù)。經(jīng)過分析，莪術(shù)醇晶體研磨后的粒徑主要集中在45 μm，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為57.66%，σg＝0.707，表示粒徑比較集中。R2＝0.991，表示對數(shù)正態(tài)擬合的相關(guān)性較好。

2.4 莪術(shù)醇片劑的制備

將處方中各組分及輔料過篩備用。稱取處方量的主藥、填充劑及崩解劑混勻，加入黏合劑制軟材。過篩制濕顆粒，干燥，整粒。加入處方量的填充劑及潤滑劑混勻，壓片，即得。

2.5 處方單因素考察

2.5.1 黏合劑和潤滑劑種類的考察 選擇聚維酮和羥丙甲纖維素為黏合劑篩選對象，硬脂酸鎂和滑石粉為潤滑劑篩選對象。分別以聚維酮&硬脂酸鎂、聚維酮&滑石粉、羥丙甲纖維素&硬脂酸鎂以及羥丙甲纖維素&滑石粉作為黏合劑或潤滑劑制備得到片劑，以片劑性能（外觀、片重差異、硬度和脆碎度）以及體外累計溶出度為考察指標(biāo)，初步確定制劑所用的黏合劑及潤滑劑種類，結(jié)果見表1。當(dāng)潤滑劑選用滑石粉時，得到的片劑有裂片現(xiàn)象，推測以潤滑劑為滑石粉時片劑壓合效果不好導(dǎo)致，所以初步確定處方潤滑劑選用硬脂酸鎂。由聚維酮&硬脂酸鎂所制得的片劑脆碎度較高，且有破碎現(xiàn)象，推測選用黏合劑為聚維酮時片劑黏合效果不好導(dǎo)致，所以初步確定處方中黏合劑選用羥丙甲纖維素。

表1 不同黏合劑和潤滑劑對莪術(shù)醇片的影響Tab 1 Effect of different adhesives and lubricants on curcumol tablets

2.5.2 主藥和黏合劑用量考察 考察不同比例的主藥和黏合劑對片劑性能和體外累計溶出度的影響，初步確定最適的主藥和黏合劑用量，結(jié)果見表2和圖2。改變主藥的含量對片劑性能的影響并不大，片劑的片重差異、硬度和脆碎度等指標(biāo)都符合標(biāo)準(zhǔn)。進一步檢測片劑累計溶出度，發(fā)現(xiàn)主藥含量會影響體外累計溶出度，只有主藥含量為13.3%時，其60 min的體外累計溶出度達到了80%以上，所以最終確定主藥含量為13.3%（見圖2A）。

表2 主藥和黏合劑不同用量對莪術(shù)醇片的影響Tab 2 Effect of different dosages of main drug and adhesive on curcumol tablets

圖2 主藥（A）與黏合劑（B）用量對莪術(shù)醇片的影響Fig 2 Effect of different dosages of main drug（A）and adhesive（B）on curcumol tablets

由表2可知，黏合劑用量改變，雖然片劑的重量、硬度和脆碎度等有差異，但總體均符合標(biāo)準(zhǔn)。圖2B片劑溶出度結(jié)果表明，黏合劑含量的不同能顯著影響片劑的體外累計溶出度，2.0%和2.5%含量的黏合劑制備出來的片劑，其在60 min時的體外累計溶出度僅為60%左右，相比較下，1.5%含量的黏合劑時其在60 min時的體外累計溶出度達到了80%以上，溶出效果較好。所以選擇1.5%黏合劑為最適用量。

2.6 體外累計溶出度評價

取自制的莪術(shù)醇片劑，參照《中國藥典》溶出度與釋放度測定法，選擇第二法槳法體外累計溶出度的測定。分別以2 mg·mL-1十二烷基硫酸鈉（SDS）的水溶液900 mL，2 mg·mL-1SDS的pH 6.8磷酸緩沖液900 mL，2 mg·mL-1SDS的pH 4.5乙酸緩沖液900 mL和2 mg·mL-1SDS的0.1 mol·mL-1鹽酸溶液900 mL作為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，不同時間點取溶液2 mL，同時補充同溫的溶出介質(zhì)2 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，利用HPLC進行測定。計算莪術(shù)醇在不同溶出介質(zhì)中的累計釋放百分率，結(jié)果見圖3，莪術(shù)醇片劑在不同溶出介質(zhì)中60 min內(nèi)溶出率達到80%，溶出率均符合要求。

圖3 莪術(shù)醇片在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線Fig 3 Dissolution curves of curcumol tablets in different dissolution media

圖4 莪術(shù)醇腸灌注液的HPLC圖Fig 4 HPLC chromatography of curcumol intestinal perfusion

2.7 大鼠在體腸循環(huán)實驗

2.7.1 酚紅濃度的測定 精密稱定酚紅25 mg于250 mL量瓶中，用蒸餾水定容，作為儲備液備用。依次取母液1、2、3、4、5、6 mL于10 mL量瓶中用蒸餾水定容，分別取上述溶液0.5 mL加0.2 mol·L-1的NaOH 5 mL混勻，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用酶標(biāo)儀在555 nm的波長下測定吸光度（A）。以A對酚紅質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程A＝53.02C+0.0356（R2＝0.9994），結(jié)果表明酚紅在0.0009～0.0054 mg·mL-1與A有較好的線性關(guān)系。

2.7.2 方法學(xué)考察 精密量取20 mg·mL-1的莪術(shù)醇對照品溶液適量，用乙醇稀釋成0～0.1 mg·mL-1的系列溶液，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程A＝6383.3C+6909.7；供試品中其他成分對目標(biāo)峰沒有干擾，見圖 4；6份樣品測得重復(fù)性RSD為1.3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7.3 大鼠在體腸循環(huán) 配制K-R腸循環(huán)液：稱取NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、CaCl21.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO30.32 g、MgCl220.02 g、葡萄糖1.4 g，加水定容至1000 mL。K-R酚紅試劑：精密稱取酚紅20 mg，用K-R腸循環(huán)液定容至1000 mL。供試液：精密稱取適量莪術(shù)醇原料藥和莪術(shù)醇片劑，用K-R酚紅試劑溶解，配制成含莪術(shù)醇20 mg·mL-1的供試液。

大鼠在體腸循環(huán)實驗準(zhǔn)備工作：將健康的SD雄性大鼠禁食12 h，可自由飲水；將配制好的K-R酚紅試液、供試液和生理鹽水放置于37℃的恒溫水浴鍋內(nèi)備用；矯正流動泵流速，使其達到2.5 mL·min-1或5 mL·min-1。取實驗用SD大鼠稱重，以4 mL·kg-1的劑量腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉后固定于手術(shù)臺板上，腹部剃毛，沿腹中線切開約3 cm的切口。找到十二指腸上端和回腸下端，兩端各開一個小口，用準(zhǔn)備好的生理鹽水沖洗腸道內(nèi)異物。將橡膠管插入腸道兩端并連接流動泵和K-R酚紅試液形成閉合回路，開啟流動泵，以5 mL·min-1的流速平衡10 min。將K-R試液換成100 mL的供試液，以5 mL·min-1的流速循環(huán)5 min，接著取樣2 mL，記為0 h，并補充同體積等溫度的K-R酚紅試液，此后每15 min取樣2 mL并補充同體積等溫度的K-R酚紅試液，循環(huán)2 h，處死大鼠。利用酶標(biāo)儀和HPLC檢測樣品中酚紅和莪術(shù)醇的含量，以剩余藥量的對數(shù)對相應(yīng)時間作圖，由直線的斜率求出吸收速率常數(shù)（Ka），并計算吸收半衰期（t1/2）和表觀吸收系數(shù)（Papp），結(jié)果見表3。與莪術(shù)醇原料藥相比，莪術(shù)醇片劑的Ka值和Papp值高于莪術(shù)醇原料藥，t1/2值低于莪術(shù)醇原料藥，采用SPSS 26統(tǒng)計軟件，對莪術(shù)醇片劑及原料藥在小腸的吸收速率常數(shù)Ka進行配對樣本t檢驗分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明莪術(shù)醇成片后在大鼠小腸內(nèi)的吸收速率得到改善。

表3 莪術(shù)醇原料藥和片劑的大鼠在體腸循環(huán)比較(n＝3)Tab 3 In situ circulation between curcumol raw material and its tablets in vivo (n＝3)

3 討論

本實驗將單體莪術(shù)醇制備成片劑，通過單因素考察初步優(yōu)化處方輔料種類以及主藥和輔料用量，并以片劑性能、體外累計溶出度為考察指標(biāo)，評價不同處方的差異。最終得到主藥莪術(shù)醇2 g、黏合劑羥丙甲纖維素0.225 g、崩解劑玉米淀粉1.5 g、潤滑劑硬脂酸鎂0.225 g、填充劑一水合乳糖11.05 g為最佳處方，莪術(shù)醇片質(zhì)量暫定為每片300 mg，制得莪術(shù)醇片50片。玉米淀粉作為經(jīng)典的崩解劑，適用于溶解性低的藥物制備成片劑[14]，低溶解性藥物在遇水崩解過程中不會產(chǎn)生濃度差，可使玉米淀粉迅速吸水膨脹發(fā)生崩解，由于生產(chǎn)中已經(jīng)確定崩解劑玉米淀粉的最佳含量為10%[15]，因此本實驗中固定了崩解劑玉米淀粉的用量，并在篩選過程中隨時調(diào)整填充劑一水合乳糖的用量以保證處方總量不變。關(guān)于體外累計溶出度的考察，溶出介質(zhì)的選擇十分關(guān)鍵，直接影響藥物溶出。實驗所用的4種溶出介質(zhì)分別模擬人體內(nèi)的胃液和腸液，且人體內(nèi)的胃腸液中存在大量相關(guān)蛋白質(zhì)，為天然的表面活性劑[16]，所以我們向4種溶出介質(zhì)中加入表面活性劑SDS以達到模擬人體內(nèi)環(huán)境的目的[17]。莪術(shù)醇微溶于水，為親脂性化合物，但當(dāng)pH降低時，溶解度呈現(xiàn)增大的趨勢[18]，所以在處方篩選時，測定體外累計溶出度時選用0.2 mg·mL-1SDS的水溶液作為溶出介質(zhì)，以此評價莪術(shù)醇片劑的體外溶出百分率。

動物實驗部分采用大鼠在體腸循環(huán)法評價莪術(shù)醇原料藥和莪術(shù)醇片劑在腸道中的吸收情況。在該實驗中，由于腸道吸收會對溶液體積產(chǎn)生影響，因此用酚紅作為參照對溶液體積進行矯正，并加入Ca2+以減少腸道對酚紅的吸收[19]。結(jié)果顯示莪術(shù)醇片劑在大鼠體內(nèi)吸收更快，這可能與輔料的影響有關(guān)。該方法保證了體內(nèi)各個器官和系統(tǒng)的完整性，盡可能地模擬了口服藥物后胃腸道的生物環(huán)境，可為莪術(shù)醇片劑進一步的臨床試驗提供參考。

本實驗證明莪術(shù)醇片劑質(zhì)量符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，具有可行性和實用性。這不僅擴大了莪術(shù)醇的應(yīng)用范圍，而且提供了莪術(shù)醇相關(guān)研究的部分?jǐn)?shù)據(jù)支撐，為莪術(shù)醇的應(yīng)用和開發(fā)提供新途徑和新思路。