張瀟丹, 劉麗莉, 于 影, 程偉偉, 徐寶成, 賀家亮, 陳樹興

1. 河南科技大學食品與生物工程學院, 食品加工與安全國家級教學示范中心, 食品加工與質(zhì)量安全控制河南省國際聯(lián)合實驗室, 功能食品資源研究與利用河南省教育廳科技創(chuàng)新團隊, 河南 洛陽 471023

2. 中原食品實驗室, 河南 漯河 462300

引 言

過度飲酒會導致酒精中毒和酒精性疾病, 包括酒精性肝硬化、 肝纖維化、 肝癌等[1]。 近年來, 許多研究已證實加速消除血清中酒精是緩解酒精性肝損傷的有效策略[2]。 乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)作為一種酒精代謝酶, 能夠加速酒精在體內(nèi)的代謝, 減輕其對肝臟系統(tǒng)、 消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的損害, 與某些肝臟疾病密切相關[3]。 對ADH進行研究并尋找維持其活性的有效途徑是十分必要的。

近年來, 對于維持和激活ADH活性的研究已成為食品科學、 化學、 藥學和臨床醫(yī)學領域的熱點[4]。 孫小紅等[5]將ADH作為靶點, 測定了荸薺提取物對其活性的影響, 結(jié)果顯示荸薺提取物能夠增強小鼠血液和肝臟中ADH活性, 進而改善小鼠急性酒精中毒; 余帶兵等[6]采用磁性納米顆粒固定化ADH, 結(jié)果表明固定化酶具有良好的耐高溫、 耐堿性和操作穩(wěn)定性; 通過酒精胃損傷模型小鼠試驗, 得出中藥材北蟲草的水提物能夠增強胃組織的ADH活性, 且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性, 進而對酒精性胃損傷起到保護作用[7]。 此外, 較多學者還研究了類黃酮、 多酚、 多糖、 生物活性肽等活性物質(zhì)對ADH的激活作用。 香菇多肽能夠激活ADH并促進酒精代謝來減輕酒精毒性[8]; 采用超聲-微波協(xié)同法提取出的佛手多糖對ADH具有很強的激活能力[9]。 盡管已經(jīng)有大量的研究關注小分子物質(zhì)對ADH活性的影響, 然而這些物質(zhì)與ADH之間確切的相互作用機制及二者互作的結(jié)合方式尚未完全了解, 研究ADH和多酚等小分子之間的互作方式及二者結(jié)合機理是十分有必要的。 研究表明茶多酚可顯著降低乙醇和乙醛濃度, 能夠增強肝和胃中ADH的活性[10]。 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)作為茶多酚的主要成分, 能夠吸收紫外線, 促進皮膚細胞再生, 且具備抗菌消炎, 消除自由基等多種抗氧化作用[11], 目前為止, 還沒有明確闡明EGCG與ADH之間相互作用機制的研究。

本研究旨在通過多光譜分析法和分子對接法探究EGCG與ADH的相互作用機制, 在分子水平上為蛋白酶與多酚的相互作用機制提供理論基礎, 同時為提高ADH的活性, 使其成為一種很有前途的解酒產(chǎn)品提供新的思路。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

乙醇脫氫酶(ADH)、 氧化型輔酶I(NAD+)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)均購自上海麥克林生化科技有限公司; Tris-HCl緩沖液購自上海源葉生物科技有限公司; 實驗室中所用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LGJ-10D真空冷凍干燥機, 上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司; UV-2600紫外分光光度計, 日本日立公司; Cary eclpise熒光分光光度計, 美國Aglient Cary elipse公司; VERTEX70傅里葉紅外光譜儀, 德國Bruker公司; DSC1型差示掃描量熱儀, 瑞士Mettler-Toledo公司; 電子掃描顯微鏡(SEM), TM3030Plus型, 日本島津公司; HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋, 常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紫外可見光譜法(UV-Vis)測定EGCG對ADH酶活的影響

在瓦勒-霍赫 (Valle&Hoch) 法[12]的基礎上稍作修改來測定ADH活性。 在10 mL試管中依次加入Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)、 乙醇溶液、 0.027 mol·L-1的氧化型輔酶I(NAD+)和一定濃度的EGCG溶液, 搖勻后放入25 ℃水浴鍋中保溫10 min。 將混合液倒入1 cm比色皿中, 立即加入0.1 mL 0.25 U·mL-1的ADH引發(fā)酶促反應, 以蒸餾水作空白調(diào)零, 在紫外分光光度計340 nm波長處讀取吸光值, 并以15 s間隔為單位, 連續(xù)測定5 min, 作標準曲線圖。 以蒸餾水代替EGCG作對照, 采用式(1)和式(2)計算 ADH 活性和EGCG對ADH的激活率。

(1)

(2)

式中,E為ADH的酶活力(U·mL-1), 其中E1是樣品組酶活力,E0是空白組酶活力;Eω為反應液的含酶量(mg·mL-1);A為每分鐘340 nm波長吸光度的增大值; 1.6為反應體系的總體積(mL); 6.2為NADH的克分子吸光值系數(shù);Q為ADH的激活率(%)。

1.3.2 三維熒光光譜法(EEM)測定EGCG與ADH的相互作用

配制2.0×10-6mol·L-1ADH溶液, 移取1.0 mL于離心管中, 加入100 μL濃度為2×10-5mol·L-1的EGCG溶液, 在298 K條件下恒溫水浴, 充分混勻后靜置5 min。 用熒光分光光度計掃描ADH及EGCG與ADH作用的三維熒光光譜, 測定條件為: 激發(fā)波長(200～300 nm), 發(fā)射波長(300～500 nm), 狹縫(10 nm)。

1.3.3 熒光光譜法(FS)測定EGCG與ADH的相互作用

取1.0 mL濃度為2.0×10-6mol·L-1的ADH溶液于試管, 依次吸取2×10-5mol·L-1的EGCG溶液100 μL加入, 在298 K條件下水浴5 min。 用熒光分光光度計對ADH和EGCG-ADH復合物的熒光進行掃描。 測定條件為: 激發(fā)波長(280 nm), 掃描范圍(290～450 nm), 激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。 此外, 將固定熒光發(fā)射與激發(fā)的波長差Δλ分別設置為15和60 nm, 對二者的同步熒光光譜圖進行掃描。

1.3.4 傅里葉紅外光譜法(FTIR)測定EGCG與ADH的相互作用

以1∶100的比例將ADH與EGCG-ADH復合物分別與干燥12 h的溴化鉀粉末混勻研細, 壓片后用傅里葉紅外光譜儀掃描圖譜。 測定條件為: 分辨率(4 cm-1), 掃描范圍(4 000～400 cm-1)。 掃描結(jié)果用OMNIC和Peak Fit v4.12軟件處理, 進行基線校正, 高斯卷積處理, 二階導數(shù)擬合, 得到圖譜的各特征峰峰面積, 并根據(jù)峰面積計算各二級結(jié)構(gòu)的比率, 進而分析復合了EGCG后ADH在酰胺Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.5 差示掃描量熱法(DSC)測定EGCG與ADH的相互作用

參考徐佳茜[13]的方法并加以改進, 用差示掃描量熱儀測ADH粉末和EGCG-ADH復合物粉末的熱變性溫度, 測定溫度范圍為20～120 ℃, 升溫速率10 ℃·min-1, 樣品量2～3 mg, 氮氣流速80 mL·min-1。

1.3.6 EGCG-ADH復合物的微觀形貌觀察

將一定濃度的ADH與EGCG溶液等比例復合, 經(jīng)真空冷凍干燥制得ADH凍干粉和EGCG-ADH復合物凍干粉。 對兩種粉末進行噴金后, 在加速電壓5 kV, 工作距離5.9 mm條件下, 用電子掃描顯微鏡(TM3030Plus型, 日本島津公司)觀察樣品, 采集放大600倍的圖片。

1.3.7 分子對接

在AutoDockTools-1.5.6軟件中進行分子對接。 乙醇脫氫酶(PDB ID: 1ADC)的晶體結(jié)構(gòu)取自Protein Data Bank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫, EGCG的分子結(jié)構(gòu)取自PubChem數(shù)據(jù)庫。 采用Autodock對ADH與EGCG進行去水與加全氫等預處理。 利用Lamarckian genetic algorithm算法對接50次, 其余參數(shù)設置為默認值, 并根據(jù)二者的結(jié)合能大小對結(jié)果排序, 最后借助Discovery Studio 2019、 Pymol等軟件進一步分析最低能量的構(gòu)象。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

對每組試驗均做3次平行試驗, 利用Origin 9.0軟件對光譜數(shù)據(jù)進行平滑處理及作圖, 采用DPS 7.05軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 UV-Vis分析EGCG對ADH酶活的影響

乙醇以NAD為輔酶, 通過ADH催化轉(zhuǎn)化為乙醛。 在整個反應體系中, NADH在340 nm處具有最大吸收。 因此, 340 nm處吸光度變化, 可以表明ADH的酶促反應速率[14]。 如圖1所示, 在340 nm處, EGCG的加入增加了ADH紫外吸收的強度, 分析認為EGCG與ADH的Trp和Tyr殘基之間新生成了共軛體系, π—π電子對能級躍遷。 ADH催化乙醇的反應速率曲線結(jié)合瓦勒-霍赫(Valle&Hoch) 法[12], 計算得出: EGCG對ADH的激活率為33.33%。

2.2 FS分析EGCG與ADH的相互作用

2.2.1 EGCG與ADH結(jié)合的三維熒光光譜分析

三維熒光光譜能夠整合生物樣品中熒光分子的特征信息, 獲取更完整的蛋白質(zhì)有效光譜信息, 同時還能反映出蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象以及發(fā)光基團的微環(huán)境變化[15]。 為進一步研究EGCG與ADH結(jié)合后體系分子構(gòu)象、 多肽骨架及殘基微環(huán)境的變化, 測定了ADH與EGCG-ADH的三維熒光光譜。 結(jié)果如圖2所示。 三維熒光光譜中主要有兩種典型峰, 其中Peak 2的光譜特性主要表現(xiàn)為Trp和Tyr殘基。 由圖2結(jié)果可知, 加入6.67×10-6mol·L-1EGCG后, Peak 1和Peak 2的熒光強度有所降低, 且最大發(fā)射波長發(fā)生了紅移, 熒光強度降低表明EGCG與ADH發(fā)生了相互作用并產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象。 紅移現(xiàn)象表明EGCG影響了ADH周圍的微環(huán)境, 使其極性增強、 親水性增大、 疏水性降低, 肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖2 ADH和EGCG-ADH的三維熒光光譜圖

2.2.2 EGCG與ADH結(jié)合的熒光光譜分析

熒光光譜學是研究配體與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法, 通過研究配體與酶之間的結(jié)合模式可以進一步探索酶促反應的激活機制[16]。 圖3顯示了ADH在不同EGCG濃度下的特征熒光光譜, 由于ADH的每個亞基中都含有芳香族氨基酸, 主要包括色氨酸殘基(Trp)和酪氨酸殘基(Tyr), 因此, ADH在340 nm處出現(xiàn)了固有熒光峰。 隨著EGCG濃度的增加, ADH的熒光強度逐漸降低, 這表明EGCG對ADH產(chǎn)生猝滅作用, 且猝滅強度與其添加量具有依賴性。 EGCG的添加使ADH的發(fā)射波長出現(xiàn)了輕微的紅移(2 nm), 這一現(xiàn)象表明EGCG與ADH之間存在相互作用, ADH蛋白主鏈疏松, 蛋白質(zhì)內(nèi)部的Trp和Tyr殘基得以暴露, ADH芳香族氨基酸周圍微環(huán)境改變, 促進了兩者之間的疏水相互作用, 形成了氫鍵[17]。

2.2.3 熒光猝滅機理的判定

為了區(qū)分EGCG對ADH的猝滅類型- 采用Stern-Volmer等式(3)分析相應的熒光強度值[18]

(3)

式(3)中:F0、F分別為加入猝滅劑前和加入后蛋白的熒光強度;Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)[L·(mol·s)-1];τ0為熒光體自身壽命, 蛋白的平均壽命約為10-8s;Q為猝滅劑濃度, mol·L-1;KSV為動態(tài)猝滅常數(shù), L·mol-1。

以F0/F為因變量, 對[Q]進行線性擬合, 結(jié)果如圖4所示, 進而通過式(3)得出Kq和KSV, 分別為2.947×1012M-1·s-1, 2.947×104(L·mol-1)。 EGCG與ADH的Stern-Volmer曲線具有良好的線性關系,R2=0.990 6。 因為在溫度298 K, EGCG-ADH配合物的Kq值為2.947×1012M-1·s-1, 遠遠大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)(2.0×1010M-1·s-1)。 結(jié)果表明, EGCG對ADH的猝滅作用形式為靜態(tài)猝滅。 Huang等[19]在對蘆丁與醇脫氫酶結(jié)合特性的研究中發(fā)現(xiàn)蘆丁與乙醇脫氫酶相互作用的熒光猝滅方式為靜態(tài)猝滅并通過時間分辨熒光法得到驗證, 與本研究結(jié)果相似。

2.2.4 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點的計算

ADH和EGCG之間的相互作用的確切性質(zhì)可以根據(jù)方程(4)計算出結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點n。

(4)

根據(jù)式(4)將相應實驗數(shù)據(jù)擬合并繪制雙對數(shù)圖, 并計算出結(jié)合常數(shù)KA為4.558×106,n為1.262。 由圖5可知, EGCG與ADH的雙對數(shù)曲線具有良好的線性關系,R2=0.997 7。 在298 K溫度下,n的值接近于1, 由此可見, EGCG在ADH上存在一個單一的結(jié)合位點。 EGCG-ADH配合物的KA值為106M-1數(shù)量級, 說明EGCG與ADH之間具有高度親和力。 這種現(xiàn)象與庹潯等[20]在研究秋水仙堿與醇脫氫酶的相互作用機理, 得出二者形成的復合物結(jié)合位點數(shù)接近于1一致。

圖5 298 K溫度下EGCG-ADH復合物的雙對數(shù)圖

2.3 FS分析EGCG-ADH的構(gòu)象變化

酶的生物學功能與其二級結(jié)構(gòu)密切相關, 因此采用同步熒光、 三維熒光光譜和FTIR光譜等廣泛應用的方法來探討EGCG與ADH相互作用后的結(jié)構(gòu)變化。 同步熒光光譜能夠提供蛋白質(zhì)中發(fā)色團的特征信息, 當Δλ為60和15 nm時, 分別獲得色氨酸殘基(Trp)和酪氨酸殘基(Tyr)的信息。 結(jié)果表明, 添加EGCG后, ADH的Trp和Tyr熒光發(fā)生猝滅[圖6(a, b)]。 這表明EGCG與ADH的結(jié)合導致ADH的熒光量子產(chǎn)率降低。 隨著EGCG濃度的增加, Tyr殘基的最大發(fā)射波長保持不變, 而Trp殘基發(fā)生了輕微紅移(3 nm)。 這些現(xiàn)象表明, EGCG誘導了ADH周圍Trp殘基的微環(huán)境極性變化, 與二者的三維熒光光譜分析結(jié)果一致。 黃國等[21]研究了EGCG對7S/11S蛋白結(jié)構(gòu)的影響, 結(jié)果與本文相似。

圖6 不同濃度EGCG與ADH作用的同步熒光圖

2.4 FTIR分析EGCG與ADH的相互作用

FTIR光譜進一步對EGCG-ADH復合物進行研究, 并分析二者的相互作用以及添加EGCG后對ADH蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)果如圖7所示。

圖7 ADH和EGCG-ADH復合物的傅里葉變換紅外光譜圖

由紅外光譜分析得出酰胺Ⅰ帶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量表1, 結(jié)果顯示, β-折疊是ADH蛋白的主要二級結(jié)構(gòu), 添加EGCG之后, ADH的α-螺旋含量從4.47%下降到1.85%, β-折疊含量從77.71%上升到92.32%。 因為酚類的—OH可以提供氫參與氫鍵的形成, 氧原子可以作為氫鍵的受體, 所以加入酚類, α-螺旋含量降低而β-折疊含量增加。 說明EGCG與ADH的結(jié)合使ADH多肽鏈的延伸, 導致了某些區(qū)域的親水性更強, 這種變化可能是影響ADH生理功能的重要因素[22]。

表1 ADH和EGCG-ADH復合物的酰胺Ⅰ帶蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量

2.5 DSC分析EGCG與ADH的相互作用

酶的熱變性與其空間構(gòu)象的變化密切相關, 比如鏈的伸展或者折疊, 都會導致酶學性質(zhì)發(fā)生改變。 差示掃描量熱儀分析復合EGCG后ADH的變性程度, 主要由變性溫度(Ts)和熱焓變(ΔH)來表示, 其中Ts是測定蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個重要指標, ΔH則主要分析疏水作用和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密性。 ADH在40～120 ℃范圍的DSC曲線如圖8所示。 ADH出峰溫度為103.31 ℃, 在106.26 ℃有一個較大的放熱峰, 熱焓為58.59 J·g-1。 EGCG與ADH相互作用后, 其變性溫度從106.26 ℃降至105.95 ℃, 說明EGCG對ADH的熱穩(wěn)定性影響并沒有很大, 但積分值從-175.78 mJ降到-73.38 mJ, 熱焓從-58.59 J·g-1減少至-24.46 J·g-1。 變性溫度的下降表明EGCG的添加促進了ADH蛋白結(jié)構(gòu)的展開, 適度地降低了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。 熱焓降低表明由于酚的引入, 酚羥基與蛋白分子骨架及側(cè)鏈上的基團之間形成氫鍵, 從而破壞或阻止了蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵的形成, 構(gòu)象部分發(fā)生伸展。 另外, 由于酚本身存在一定的空間結(jié)構(gòu), 與蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)合使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散, 提高了多肽鏈的移動性和柔性。 與黃國等[23]對矢車菊素-3-葡萄糖苷與β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的互作情況探究所得到的結(jié)果一致。

圖8 ADH和EGCG-ADH的DSC掃描圖

2.6 SEM分析EGCG-ADH的構(gòu)象變化

掃描電鏡可以反映復合物的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。 圖9為ADH和EGCG-ADH復合物的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)圖, 放大倍數(shù)為600倍。 通過觀察可以得到ADH粉末[圖9(a)]呈現(xiàn)紋理清晰的片狀薄層結(jié)構(gòu)。 而加入了EGCG的電鏡掃描照片[圖9(b)], 其表面為粗糙的珊瑚狀結(jié)構(gòu), 說明EGCG成功與ADH復合, 明顯改變了ADH的結(jié)構(gòu)。

2.7 分子對接法分析EGCG與ADH的相互作用

分子對接法能夠?qū)Ψ肿踊プ鬟M行有效分析, 并提供更多有關EGCG與ADH之間相互作用的信息。 一般來說, 在ADH的催化氧化過程中, 輔酶NAD和底物醇的結(jié)合都會影響ADH的催化效率, 因此, 將鋅離子、 底物和輔酶在ADH上的結(jié)合位點分別設置為對接中心進行分子模擬。 如圖10所示, EGCG被ADH的氨基酸殘基包圍, 且與ADH的三個氨基酸殘基結(jié)合, 即EGCG與Arg-133、 Glu-24、 Ile-23結(jié)合形成氫鍵, 這使得復合體更加穩(wěn)定。 分子對接的結(jié)果顯示, EGCG的苯環(huán)與ADH主要通過氫鍵和范德華力相互作用, 且為酶促反應實驗中EGCG對ADH活性的激活作用提供了一個合理解釋。

圖10 ADH與EGCG結(jié)合的分子對接示意圖

3 結(jié) 論

采用多種光譜學方法結(jié)合分子對接技術對ADH與EGCG的相互作用進行了研究。 結(jié)果表明: EGCG對ADH具有激活作用, 激活率為33.33%; 加入EGCG后, ADH的Trp和Tyr發(fā)生熒光猝滅, 蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了變化, 疏水性降低, 且二者形成了基態(tài)穩(wěn)定復合物, 其相互作用的熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅; 與ADH相比, EGCG-ADH復合物的二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生了變化, 其中α-螺旋含量降低, β-折疊含量升高。 通過熱穩(wěn)定性分析, 進一步表明二者的相互作用影響了蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵的形成, 構(gòu)象部分發(fā)生伸展。 此外, 掃描電鏡和分子對接仿真模型進一步證實了二者復合后的結(jié)構(gòu)變化。 本研究對EGCG激活ADH的作用機制開展深入的研究, 進而為解酒劑替代品的制備提供理論指導。