薛志超, 曾嘉明, 龔曉云, 薛 倩, 戴新華, 趙 洋

(中國計量科學(xué)研究院 前沿計量科學(xué)中心 國家市場監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心(質(zhì)譜)，北京 100029)

1 引 言

體外培養(yǎng)的模式細(xì)胞是生物功能驗證、靶向藥物開發(fā)以及生理機(jī)制探究的重要實驗材料,在人類疾病基因篩查,基因編輯,新藥開發(fā)與篩查等生物前沿科技領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。在藥物研發(fā)過程中,細(xì)胞模型驗證是藥物有效性篩查的第一步,也是最關(guān)鍵步驟[1]。高質(zhì)量的細(xì)胞模型控制,一方面可以提高實驗準(zhǔn)確性,避免實驗誤差導(dǎo)致的假陽性結(jié)論[2,3],降低實驗成本,提高實驗成功率;另一方面,可以有效保障不同實驗室測量數(shù)據(jù)的可比性與溯源性[4]。

國內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研顯示,在細(xì)胞實驗過程中,如何精確、高效、高質(zhì)量地實現(xiàn)細(xì)胞活性檢測和細(xì)胞狀態(tài)評估,尚處于研究空白,因而是生命科學(xué)計量領(lǐng)域亟需發(fā)展的研究內(nèi)容[5]。在細(xì)胞活性測量中,細(xì)胞的繁殖數(shù)量是細(xì)胞模型實驗的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[6]。細(xì)胞繁殖數(shù)量是隨著時間增加不斷增加的,其增殖速度是由細(xì)胞活性及其繁殖能力決定的。因此,通過對細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計,可以初步反映細(xì)胞的活性狀態(tài)和繁殖能力,實現(xiàn)細(xì)胞活性與狀態(tài)的初始精準(zhǔn)測量。

海拉(Hela)細(xì)胞是第一個被成功分離培養(yǎng)的人類卵巢癌細(xì)胞,是經(jīng)典的模型細(xì)胞之一[7～9]。海拉細(xì)胞屬于貼壁細(xì)胞,其生存和繁殖需要貼壁進(jìn)行,懸浮狀態(tài)對于海拉細(xì)胞是一種不良環(huán)境,會誘導(dǎo)細(xì)胞失巢凋亡[10]。海拉細(xì)胞是研究失巢凋亡現(xiàn)象非常好的模式細(xì)胞。實驗過程中,可能由于各種因素,導(dǎo)致細(xì)胞懸浮時間過長,引起細(xì)胞凋亡,影響細(xì)胞活性[11],最終影響實驗結(jié)果。綜上,本研究以海拉細(xì)胞為實驗對象,探究懸浮時間對細(xì)胞活性及其繁殖能力的影響,深入評價細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,建立細(xì)胞活性的時間評價模型,進(jìn)行試驗驗證,為貼壁細(xì)胞的測量研究提供理論和實驗的支撐。最終,通過系統(tǒng)的時序研究,表征細(xì)胞失巢凋亡過程,助力前沿生物科技發(fā)展與靶向藥物開發(fā)[10,12]

2 材料和方法

海拉細(xì)胞來源于BNCC細(xì)胞庫,編號338703,培養(yǎng)于5%CO2、溫度37℃培養(yǎng)箱,使用90%培養(yǎng)液RPMI-I640(Solarblo 31800)與10%胎牛血清(四季青, 11011-8611)作為培養(yǎng)基。

細(xì)胞試驗: 如圖1所示,使用0.25%EDTA-胰蛋白酶(Solarblo, T1300)消化海拉細(xì)胞,并懸浮于離心管中,使用臺盼藍(lán)溶液(Sigma,#T8154)與細(xì)胞懸液1:1混合,于顯微鏡下使用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。在每個時間點(diǎn),將6×105個活細(xì)胞接種于6孔板中,搖勻后放入培養(yǎng)箱。24 h后,取出細(xì)胞,重新消化計數(shù),并且將細(xì)胞收集進(jìn)行下一步免疫印跡。每個時間點(diǎn)均準(zhǔn)備3個樣本,每個樣本進(jìn)行3次計數(shù),實驗結(jié)果為9次細(xì)胞計數(shù)的平均值。

圖1 實驗流程Fig.1 Experimental procedures

結(jié)晶紫染色 :細(xì)胞用100%甲醇于冰上固定15 min;之后用0.5%結(jié)晶紫(Solarbio, #C8470)固定30 min;隨后流水清洗,放于室溫并自然晾干。使用顯微鏡4×目鏡隨機(jī)選擇3個視野拍照,使用ImageJ軟件計算平均值。

免疫印跡法 :檢測海拉細(xì)胞Cyclin A蛋白表達(dá)水平,實驗具體分組和處理步驟同前。收集各時間點(diǎn)細(xì)胞,1 200 r/min離心5 min,留取細(xì)胞沉淀并用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次。棄上清后,加入適量RIPA(Solarblo,#R0020-100)裂解液充分裂解細(xì)胞,并以10 000 r/min離心30 min,取上清,BCA(碧云天,#P0010)法檢測上清液中蛋白濃度。取5 μg變性煮沸蛋白樣品上樣,用100 g/L的SDS PAGE在蛋白電泳儀(Bio-Rad)中分離蛋白,通過半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad,)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immun-Blot?,# IEVH00005)上;0.5%脫脂奶粉室溫封閉0.5 h,分別加入以1:1 000稀釋的Cyclin A抗體(Santa Cruze, sc-271682),GAPDH抗體(Santa Cruze,sc-47724),4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次10 min,接著加入HRP標(biāo)記的二抗(Santa Cruze,sc-516102),室溫孵育1 h;最后,用ECL(Bio-Rad,1705060Clarity)化學(xué)發(fā)光試劑凝膠顯影。利用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。Cyclin A灰度值/GAPDH灰度值比值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

統(tǒng)計分析 :細(xì)胞計數(shù)和細(xì)胞匯合度測量重復(fù)3次,細(xì)胞計數(shù)結(jié)果以3次計數(shù)平均值及總標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)胞懸浮時長對細(xì)胞活性影響

貼壁細(xì)胞在消化后被迫懸浮時,將經(jīng)歷抗失巢凋亡的過程,懸浮時間是極大的不確定因素,會嚴(yán)重影響細(xì)胞活性與狀態(tài),從而影響整個細(xì)胞實驗過程。本研究通過活細(xì)胞計數(shù)實驗,評價了懸浮時長對細(xì)胞活性的影響,結(jié)果如圖2和表1所示。貼壁的海拉細(xì)胞消化后置于15 ml離心管,離心后加新鮮培養(yǎng)基重懸。消化離心過程共需5 min,對該時間點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)及接種,此時間點(diǎn)作為參考點(diǎn)記為 5 min。計數(shù)時取10 μL細(xì)胞懸液混合10 μL臺盼藍(lán)進(jìn)行活細(xì)胞顯微鏡計數(shù)實驗, 3組重復(fù)實驗結(jié)果分別為100%±7.6%,100%±7.5%和100%±8.5%。

表1 細(xì)胞消化后懸浮時間及細(xì)胞數(shù)量Tab.1 Suspension time and number of cells after digestion

圖2 細(xì)胞消化后懸浮時間及細(xì)胞數(shù)量Fig.2 Suspension time and number of cells after digestion

相對于懸浮5 min細(xì)胞溶液,懸浮30 min后,3組重復(fù)實驗的活細(xì)胞計量結(jié)果分別為95.5%±5.5%,90.0%±6.6%和93.0%±2.6%。懸浮1 h 后活細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)降低,分別為81.3%±3.3%,80.0%±4.2%和85.4%±3.2%。懸浮2 h后活細(xì)胞數(shù)量降低為81.6%±7.8%,81.0%±8.6%和82.0%±4.0%。懸浮4 h后活細(xì)胞數(shù)量為79.8%±10.5%,79.5%±6.2%和86.0%±1.8%。懸浮8 h后活細(xì)胞數(shù)量為80.0%±2.6%,87.4%±11.3%和83.0%±4.9%?？傮w而言,隨著懸浮時間的延長,細(xì)胞活性呈現(xiàn)下降趨勢,當(dāng)懸浮時間達(dá)到1 h后,活細(xì)胞數(shù)量趨于穩(wěn)定,且每次重復(fù)實驗結(jié)果相似。

3.2 懸浮細(xì)胞貼壁再培養(yǎng)活性評價

隨后,我們將每個懸浮時間點(diǎn)的細(xì)胞按照6×105細(xì)胞量重新接種于6孔板中進(jìn)行貼壁培養(yǎng),評價細(xì)胞經(jīng)歷失巢凋亡后的細(xì)胞活性。如圖3和表2所示,懸浮細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后,我們利用顯微鏡對培養(yǎng)板中的細(xì)胞匯合度比表面積進(jìn)行了統(tǒng)計分析。同樣,以懸浮5 min細(xì)胞為參考點(diǎn),貼壁培養(yǎng)24 h后細(xì)胞混合度為100.0%±3.0%。懸浮30 min后細(xì)胞匯合度比表面積顯著降低,參考數(shù)值為81.0%±7.6%。懸浮1 h,2 h,4 h和8 h后,細(xì)胞的增殖速度明顯增強(qiáng),表現(xiàn)為細(xì)胞匯合度比表面積顯著提高,分別為111.5%±2.3%,118.0%±3.0%,134.0%±3.6%,140.6%±5.1%。結(jié)果表明,細(xì)胞懸浮30 min后,細(xì)胞活性受到明顯影響;然而隨著時間延長,細(xì)胞懸浮液中活性強(qiáng)的細(xì)胞通過生存選擇存活下來,因此表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞生存繁殖能力。

表2 重新貼壁培養(yǎng)24 h后細(xì)胞匯合度及細(xì)胞計數(shù)Tab.2 Cell confluence and cell counts after24 h of re-adherent culture

圖3 重新貼壁24 h后細(xì)胞匯合度Fig.3 Cell confluence at 24 h after reseeding

同時,我們對懸浮細(xì)胞貼壁再培養(yǎng)后的活細(xì)胞進(jìn)行了計數(shù)統(tǒng)計,結(jié)果如表2所示。采用懸浮5 min時間的活細(xì)胞數(shù)量作為參考點(diǎn),計數(shù)統(tǒng)計為100.0%±7.8%和100.0%±5.3%。懸浮30 min細(xì)胞貼壁再培養(yǎng)24 h后,活細(xì)胞數(shù)量降低為73.9%±10.1%和80.4%±7.3%。懸浮1 h細(xì)胞的活細(xì)胞計數(shù)回升為98.1%±7.6%和129.2±7.7%。懸浮2 h,4 h和8 h的細(xì)胞都表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力,活細(xì)胞計數(shù)分別為126.5%±7.2%和123.1%±7.1%、115.8%±10.8%和129.0%±6.0%、140.0%±18.6%和148.5%±8.2%。以上結(jié)果與細(xì)胞匯合比表面積結(jié)果基本吻合,進(jìn)一步證明了細(xì)胞懸浮30 min后,經(jīng)歷失巢凋亡后,細(xì)胞活性顯著降低。

3.3 懸浮細(xì)胞貼壁再培養(yǎng)細(xì)胞活性驗證

不同懸浮時間點(diǎn)細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后,利用磷酸緩沖鹽溶液清洗3次并離心收集細(xì)胞,凍存于-80 ℃冰箱,待后續(xù)實驗使用。隨后,利用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白質(zhì),進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測試。本研究選用細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A(CyclinA)作為細(xì)胞活性的評價標(biāo)準(zhǔn)。CyclinA是1種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的蛋白質(zhì),主要參與DNA的復(fù)制與分裂過程,是細(xì)胞繁殖過程中的關(guān)鍵蛋白質(zhì),可以作為細(xì)胞活性及其增殖能力評價物質(zhì)[13,14]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參[15]。通過ImageJ軟件進(jìn)行灰度定量分析后,以懸浮5 min細(xì)胞作為參考點(diǎn),定義為100%。細(xì)胞懸浮30 min,1 h,2 h,4 h和8 h后,再貼壁培養(yǎng)24 h后細(xì)胞周期蛋白A的相對表達(dá)量分別為38.8%,73.2%,81.6%,99.5%和100.4%,如表3和圖4所示。結(jié)果表明,細(xì)胞懸浮30 min后,細(xì)胞的增殖能力和狀態(tài)受到嚴(yán)重影響,相對于懸浮5 min后貼壁培養(yǎng)細(xì)胞, CyclinA表達(dá)量降低61.2%,反應(yīng)其增殖能力降低了61.2%。因此,細(xì)胞懸浮30 min后,其細(xì)胞活性有一定程度的降低。

表3 CyclinA相對表達(dá)量灰度值Tab.3 Relative expression gray value of CyclinA

圖4 重新貼壁24 h后CyclinA相對表達(dá)量Fig.4 Relative CyclinA expression at 24 h after relabeling

4 結(jié) 論

本研究利用海拉細(xì)胞,系統(tǒng)性研究了貼壁培養(yǎng)細(xì)胞消化懸浮時長與細(xì)胞失巢凋亡過程的時序關(guān)系,初步建立了1種細(xì)胞失巢凋亡時序評價模型。研究發(fā)現(xiàn)懸浮時長,對細(xì)胞活性及其增殖能力有顯著影響。當(dāng)海拉細(xì)胞被迫懸浮至30 min時,部分不具有抗失巢凋亡能力的細(xì)胞出現(xiàn)死亡。細(xì)胞再次貼壁培養(yǎng)后,只有本身具備抗失巢凋亡的細(xì)胞群體能夠繼續(xù)增殖。在參與計數(shù)時,不具備抗失巢凋亡能力的細(xì)胞雖然暫時存活,被計算到活細(xì)胞中,但其無法再次貼壁或勉強(qiáng)貼壁后不再具有增殖能力。這使得整體細(xì)胞的平均活性和增殖能力降低,具體表現(xiàn)為細(xì)胞生長數(shù)量和細(xì)胞周期蛋白質(zhì)A顯著下降。隨著懸浮時間的延長,達(dá)到1 h,2 h,4 h或8 h后,具有抗失巢凋亡的細(xì)胞被篩選保留,其細(xì)胞活性和增殖能力更強(qiáng),所以表現(xiàn)為貼壁培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞數(shù)量更多,且細(xì)胞繁殖能力更強(qiáng)。該類細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過程中,通?？梢皂樦?淋巴液轉(zhuǎn)移到新的臟器[11,16,17]。同時,該類細(xì)胞通常也具有更強(qiáng)的藥物耐受性[18],會影響細(xì)胞靶向藥物篩查結(jié)果可靠性,增加生物學(xué)實驗不確定度。

綜上所述,本研究利用海拉細(xì)胞,初步建立了1種細(xì)胞失巢凋亡時序評價模型,發(fā)現(xiàn)了懸浮細(xì)胞失巢凋亡是影響海拉細(xì)胞計數(shù)和活性的重要因素,為生物細(xì)胞實驗過程提供了1種數(shù)據(jù)參考和理論支持。在進(jìn)行細(xì)胞實驗時,應(yīng)嚴(yán)格評估細(xì)胞狀態(tài),從而控制實驗系統(tǒng)誤差,提高實驗可重復(fù)率,保障不同實驗室之間的數(shù)據(jù)可比性。