劉碧涵，王 峰，張陸成，袁建輝，*

1.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，MSSA）是一種常見的革蘭陽(yáng)性致病菌，其可感染人體的胃腸道、皮膚和鼻腔等部位，引發(fā)皮膚感染和心內(nèi)膜炎等疾病[1]。隨著抗生素的廣泛使用，一些MSSA 對(duì)常用的甲氧西林類藥物產(chǎn)生了耐藥性，這類細(xì)菌被稱為“耐甲氧西林金黃色葡萄球”（Methicili-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）[2]，該菌也是引起體內(nèi)感染的重要病原菌之一。相較于MSSA，MRSA 能夠分泌多種毒力因子，更難被普通藥物殺滅，會(huì)嚴(yán)重危及患者的生命安全[3]。白花丹素（plumbagin）是從傳統(tǒng)中草藥白花丹中提取的一種羥基萘醌類化合物[4]，其在抗癌、抗菌、抗炎等方面表現(xiàn)出了很強(qiáng)的生物活性[5]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，白花丹素對(duì)多種細(xì)菌都具有抑制作用，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、聚集、代謝等都產(chǎn)生了影響。本文基于此研究白花丹素對(duì)MRSA 和MSSA 的抑菌效果，有助于發(fā)現(xiàn)新的抗菌作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：金黃色葡萄球菌（ATCC 25293，MSSA）與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ATCC 43300，MRSA），菌株由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物教研室贈(zèng)予，保存在-80 ℃的冰箱中，復(fù)蘇使用；TSB 培養(yǎng)基，TSA 瓊脂培養(yǎng)基，0.1%結(jié)晶紫水溶液（北京Solarbio）。

實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒THZ100），超純水機(jī)（YYTIII-20L），超低溫冰箱（海爾DW-86L578J），培養(yǎng)箱（ZXDP-A2160），醫(yī)用冷藏冰凍冰箱（海爾HYCD-282），生物安全柜（海爾HR40-IIA2），TriStar2 LB942 多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)Berthold）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定白花丹素對(duì)MSSA 和MRSA 的MIC

將MSSA 和MRSA 復(fù)蘇后，在TSB 培養(yǎng)基中傳代三次；在96 孔板中對(duì)白花丹素進(jìn)行梯度稀釋，使藥物質(zhì)量濃度依次為512、256、128、64、32、16、8、4、2、0 μg/mL，加入對(duì)應(yīng)的細(xì)菌懸液，使細(xì)菌濃度達(dá)到1×105CFU/mL，以無(wú)菌TSB 肉湯為陰性對(duì)照；37 ℃恒溫震蕩搖床過(guò)夜培養(yǎng)，次日觀察孔內(nèi)的渾濁程度，肉眼澄清即為最低抑菌濃度（Minimal Inhibit Concentration，MIC）。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 測(cè)定白花丹素對(duì)MSSA 和MRSA 的MBC

在進(jìn)行1.2.1 的實(shí)驗(yàn)后，選擇96 孔板中未產(chǎn)生渾濁的澄清孔，每孔取10 μL 涂布在TSA 平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)即為最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 建立MRSA 和MSSA 的生物被膜體外模型

MRSA 和MSSA 分別傳代三次后，用培養(yǎng)基將菌液稀釋，調(diào)整OD600為0.5；在96 孔板中每孔加入200 μLTSB 和2 μL 菌液，盡量避免出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象；于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)結(jié)束后，棄去TSB 培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS 溶液緩慢清洗，得到金葡菌成熟的生物膜體外模型。

1.2.4 使用結(jié)晶紫染液測(cè)量白花丹素對(duì)成熟生物膜的清除情況

得到生物膜體外模型后，棄去舊TSB 培養(yǎng)基，在孔板中分別加入預(yù)先用TSB 培養(yǎng)基稀釋好的白花丹素（512、256、128、64、32、16、8、4、0 μg/mL），每孔加入200 μL，每個(gè)濃度重復(fù)三組。藥物作用24 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入無(wú)菌水輕柔潤(rùn)洗一遍；加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫水溶液，室溫染色20 min，棄去染液，再用無(wú)菌水輕輕潤(rùn)洗兩遍，置于烘箱中15 min 烘干，用30%的乙酸將其溶解，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量OD575。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.4.2 作圖，S 用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIC 測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白花丹素對(duì)MSSA 和MRSA 均有明顯的抑制作用，對(duì)MSSA 和MRSA 的MIC 分別為16 μg/mL 和8 μg/mL（見表1）。這表明在菌液中懸浮培養(yǎng)時(shí)，白花丹素對(duì)MRSA 的清除效果更佳。

表1 白花丹素對(duì)MSSA 和MRSA 的MIC、MBC

2.2 MBC 測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白花丹素對(duì)MSSA 和MRSA 都具有明顯的殺傷作用，對(duì)MSSA 和MRSA 的MBC 均為32 μg/mL（見表1）。

2.3 白花丹素對(duì)MSSA 成熟生物膜的清除作用

當(dāng)未使用白花丹素對(duì)其進(jìn)行處理時(shí)，MSSA 菌群生長(zhǎng)狀況良好，24 h 后生物膜的形成到達(dá)穩(wěn)定期。在加入4 μg/mL 白花丹素的條件下，MSSA 菌群的生長(zhǎng)開始受到抑制，OD575值下降至1.0 左右，且對(duì)濃度存在依賴性，濃度越高抑制作用越強(qiáng)；當(dāng)白花丹素的質(zhì)量濃度增長(zhǎng)到128 μg/mL 時(shí)，菌群的生長(zhǎng)能力下降更加明顯，OD575值可下降至0.5 左右；差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如圖1 所示，***P<0.001）。

圖1 白花丹素對(duì)MSSA 成熟生物膜的清除能力

2.4 白花丹素對(duì)MRSA 成熟生物膜的清除作用

未使用白花丹素進(jìn)行處理時(shí)，MRSA 菌群的生長(zhǎng)狀況良好，24 h 后生物膜的形成量趨于穩(wěn)定。當(dāng)加入的白花丹素的質(zhì)量濃度達(dá)到32 μg/mL 時(shí)，MRSA 菌群的生長(zhǎng)開始受到抑制，OD575值下降至0.7 左右，且對(duì)濃度存在依賴性，隨著白花丹素濃度升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)；當(dāng)白花丹素的濃度增長(zhǎng)到512 μg/mL 時(shí)，OD575值可下降至0.5 左右，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2，**P<0.01、***P<0.001）。

圖2 白花丹素對(duì)MRSA 成熟生物膜的清除能力

3 討論

MSSA 是常見的食源性致病菌，其可引發(fā)食物中毒，給機(jī)體健康造成危害；還可以黏附到可植入的醫(yī)療設(shè)備上，引起生物膜感染。近年來(lái)，藥物濫用導(dǎo)致MRSA 大量產(chǎn)生，MRSA 與普通的金葡菌相比具有更強(qiáng)的生物膜形成能力。由細(xì)菌群落組成的復(fù)雜無(wú)底多細(xì)胞聯(lián)合體被稱為“生物膜”[6]，細(xì)菌在生物膜狀態(tài)下對(duì)抗菌劑的敏感性會(huì)降低，生長(zhǎng)和代謝速度也會(huì)減緩，這導(dǎo)致金葡菌的治療更加困難，尋找可替代藥物進(jìn)行治療迫在眉睫。

本實(shí)驗(yàn)研究了白花丹素對(duì)MSSA 和MRSA 的體外抑菌效果，確定其在溶液中對(duì)兩種金葡菌均有顯著的抑制效果，對(duì)MRSA 的抑制效果尤其優(yōu)秀，MIC 僅為8 μg/mL。在應(yīng)對(duì)生物被膜狀態(tài)時(shí)，白花丹素也發(fā)揮了明顯的清除作用，但相較于MSSA，MRSA 的生物膜顯然更難被清除，這與其耐藥特性和獨(dú)特的群落感應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)，也是我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中需要多加關(guān)注的焦點(diǎn)；可以與其他藥物聯(lián)合使用，讓白花丹素更有效地作用于MRSA 的生物膜系統(tǒng)，從而全方位地對(duì)MSSA 造成殺傷。對(duì)白花丹素的抗菌效果進(jìn)行深入研究，不僅有助于尋找抗生素的替代療法，而且能為研發(fā)新型抗菌藥物開辟新途徑。