趙 飄，唐夢(mèng)珂，昝永強(qiáng)

1.臨沂大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.臨沂大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 臨沂 276000；3.臨沂市婦女兒童醫(yī)院（大學(xué)院區(qū)），山東 臨沂 276000

次氯酸鈉（NaClO）作為一種弱酸，不僅經(jīng)常應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)生活中，也廣泛存在于生物體的細(xì)胞內(nèi)。

目前以熒光探針為基礎(chǔ)的熒光成像技術(shù)憑借其強(qiáng)大的時(shí)間、空間分辨能力和高靈敏度而廣受關(guān)注，近年來，Zhang 等[1]開發(fā)了一種可以在生理?xiàng)l件下檢測(cè)次氯酸的新型熒光探針，其響應(yīng)速度快（t1/2<30 s）且熒光增強(qiáng)倍數(shù)大（>1 000 倍），具有很高的靈敏度和選擇性。Afzal 等[2]以Rhodol 分子為骨架，螺環(huán)肼基為次氯酸反應(yīng)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了一種新型熒光探針。并在探針中引入兩個(gè)羥乙基以提高探針的親水性能，從而實(shí)現(xiàn)了在純水中對(duì)次氯酸快速的特異性檢測(cè)。盡管至今已經(jīng)有了較多有關(guān)次氯酸檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道，但當(dāng)前的探針仍存在一定的缺陷，比如選擇性差、響應(yīng)速度慢等，所以本文以對(duì)氨基苯酚為反應(yīng)基團(tuán)，以具有強(qiáng)熒光發(fā)射的Rhodol 染料為熒光團(tuán)，設(shè)計(jì)合成了對(duì)次氯酸具有高選擇性的熒光探針。

1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

試劑：DMF、NaClO、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、NaF、NaCl、（NH4）2SO4、Mn（ClO4）2·6H2O、TBHP、MgCl2·6H2O、H2O2、ZnCl2、NaNO3、NaNO2、Cu（NO3）2·3H2O、FeCl2·4H2O。

儀器：NilkonCesi 激光共聚焦顯微鏡（日本）。

2 熒光探針Rh-p-Ap 的合成

合成中間體1∶1.01 g 間苯二酚、1.40 g 對(duì)氯硝基苯和1.68 g 干燥K2CO3，溶于20 mL DMF 中，使用N2保護(hù)，反應(yīng)溫度為100 ℃，反應(yīng)12 h。用二氯甲烷和水進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，過柱子，淋洗劑為PE/DCM =1/0-1/1。得到1.77 g 淺黃色中間體1，產(chǎn)率為89%。

合成中間體2：將2.12 g 的2-（4-N，N-二乙氨基-2-羥基苯甲?；┍郊姿岷?.49 g 中間體1 溶于15 mLTFA 中，反應(yīng)溫度為85 ℃，反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后，加水稀釋，將溶液的pH 調(diào)至中性。使用DCM 和水進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，過柱子，淋洗劑為DCM/EA = 10/1-3/1。得到1.93 g 粉紅色中間體2，產(chǎn)率為62%。

合成中間體3：將1.55 g 中間體2 溶于20 mL干燥的EtOH 中，在攪拌、冰浴的條件下緩慢加入2 mLH2SO4，使用N2保護(hù)，在85 ℃的條件下反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后，加水稀釋，再加入3 g 的NaCl，攪拌30 min，后將溶液的pH 調(diào)至中性。使用DCM 和水進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相，過柱子，洗脫劑為DCM/EtOH= 20/1-5/1。得到1.57 g 紅色中間體3，產(chǎn)率為90%。

合成探針Rh-p-Ap：將中間體3 和3.94 g 的SnCl2·2H2O 溶于20 mL 干燥的EtOH 中，加入0.2 mL 濃鹽酸，使用N2保護(hù)，85 ℃條件下反應(yīng)10 h。反應(yīng)完成后冷卻至室溫，將反應(yīng)物倒入水中，再加水將溶液的pH 調(diào)至中性，過濾，固體部分用10 mLDCM洗3 次，收集濾液，濾液用20 mLDCM 萃取3 次，合并有機(jī)相，干燥后旋干，過柱子，洗脫劑為DCM/EtOH = 20/1-5/1。得到0.72 g 紅色探針Rh-p-Ap，產(chǎn)率為61%。

3 結(jié)果與討論

3.1 Rh-p-Ap 識(shí)別性能的研究

首先，本研究測(cè)試了探針對(duì)不同濃度ClO-的響應(yīng)。如圖1a）所示，向含探針的PBS/EtOH=4/1（pH =7.4，10 mM）溶液中加入不斷增多量的ClO-，溶液的熒光強(qiáng)度也逐漸增加，當(dāng)加入8 倍濃度的ClO-時(shí)，探針熒光強(qiáng)度達(dá)到了最高峰。表明隨著ClO-濃度的增大，更多的探針被氧化生成了相應(yīng)量的Rhodol 染料。這是因?yàn)樘结槾嬖诎被交Y(jié)構(gòu)向Rhodol 部分的PET 過程，如圖1b）所示，導(dǎo)致探針的熒光被淬滅，探針本身沒有熒光；與次氯酸鈉反應(yīng)后，探針氨基苯基結(jié)構(gòu)被氧化成對(duì)氨基苯醌結(jié)構(gòu)，從熒光團(tuán)上脫落下來，生成具有強(qiáng)熒光發(fā)射的Rhodol 染料，因此探針的熒光強(qiáng)度隨著次氯酸鈉濃度的增大而逐漸增強(qiáng)。本研究使用三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差法CDL=3σ/k 測(cè)得探針Rh-p-Ap 對(duì)ClO-的檢測(cè)限為57.63 nM，如圖1c）所示。

圖1 Rh-p-Ap 與NaClO 反應(yīng)的a）熒光光譜、b）反應(yīng)機(jī)理圖及c）檢測(cè)限測(cè)定圖

下一步，我們研究了探針ClO-的選擇性及其抗干擾性。如圖1a）所示，向探針溶液中加入各種干擾離子后，探針Rh-p-Ap 的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，只有加入次氯酸后探針熒光強(qiáng)度才有了非常明顯的增強(qiáng)，表明探針對(duì)次氯酸具有非常高的選擇性。而向含有探針的溶液中加入其他干擾離子后再加入ClO-，結(jié)果如圖2b）所示，探針與ClO-和其他離子共存反應(yīng)的熒光強(qiáng)度與探針單獨(dú)加ClO-的熒光光譜幾乎一致，表明在有其他干擾離子的情況下，探針仍然可以檢測(cè)到ClO-，具有很強(qiáng)的抗干擾性。

圖2 探針檢測(cè)次氯酸鈉的a）選擇性和b）抗干擾性圖

3.2 探針Rh-p-Ap 的細(xì)胞成像研究

為了進(jìn)一步探針在生物方面的應(yīng)用價(jià)值，本研究首先用cck-8 法測(cè)試了探針Rh-p-Ap 對(duì)細(xì)胞活性的影響，如圖3 所示，可見探針濃度在10 μM 以內(nèi)細(xì)胞中的存活率大約在80%以上，證明Rh-p-Ap探針對(duì)細(xì)胞的毒性不大。

圖3 A）不同濃度探針與海拉細(xì)胞共孵育12 h 后細(xì)胞活性圖；B）a）探針明場(chǎng)圖；d）探針熒光圖；b）探針加ClO-明場(chǎng)圖和e）成像圖；LPS、PMA 孵育后加探針c）明場(chǎng)圖和f）成像圖

接下來，利用熒光顯微鏡成像技術(shù)測(cè)試探針Rh-p-Ap 在Hela 細(xì)胞中對(duì)內(nèi)源和外源次氯酸根的識(shí)別效果。如圖3（d）所示，加入探針的Hela 細(xì)胞沒有熒光，加入ClO-溶液后，在細(xì)胞中能夠觀察到熒光明顯增強(qiáng)，如圖3（e）所示，證明探針能夠用于外源性ClO-的細(xì)胞成像。在用脂多糖和佛波醇酯刺激產(chǎn)生活性氧的細(xì)胞中加入探針，如圖3（f）所示，成像觀察到了很強(qiáng)的熒光發(fā)射，證明Rh-p-Ap 能對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性ClO-有響應(yīng)。

4 結(jié)語

綜上所述，本文設(shè)計(jì)并合成的新型熒光探針Rh-p-Ap，以Rhodol 分子為骨架，以對(duì)氨基苯醌為識(shí)別基團(tuán)，可以選擇性地響應(yīng)次氯酸根離子。Rh-p-Ap 探針在PBS/乙醇=4/1（pH = 7.4，10 mM）溶液中能夠?qū)ClO 迅速反應(yīng)，且熒光光譜顯示熒光明顯增強(qiáng)。檢測(cè)限為57.63 nM，此外，探針對(duì)海拉（Hela）細(xì)胞的毒性較低，能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的外源性和內(nèi)源性HClO 成像。因此，探針有望成為生物條件下檢測(cè)次氯酸根離子的重要手段。