段 穎，譚澄瑩，李國柱，秦國宏

南京正大天晴制藥有限公司，南京 210046

生物類似藥因具有療效好、性價比高等優(yōu)勢，近年來在國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)中掀起了研發(fā)熱潮[1]。但其本身結構復雜，存在多樣性修飾。生產(chǎn)過程的復雜性和研發(fā)企業(yè)對原研了解的局限性，決定了類似藥研發(fā)的難度較大[2]。

類似藥的質量分析對檢驗方法提出了極大的挑戰(zhàn)[3]。純度作為抗體的關鍵質量屬性[4]，也是質量分析的重點[5-6]。十二烷基硫酸鈉毛細管電泳（capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，CE-SDS）憑借其高靈敏度和高分辨率為抗體的純度分析提供了高質量數(shù)據(jù)[7-8]。

本研究以IgG4 型生物類似藥為例，建立了毛細管電泳法，解決了體積排阻色譜法（size exclusion high performance liquid chromatography，SE-HPLC）進行純度分析的局限性。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

Acquity Arc 高效液相色譜儀（Waters 公司）；XSR204 電子天平（精度：0.1 mg；Mettler Toledo 公司）；Maurice 毛細管電泳儀（ProteinSimple 公司）；MK-10 干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）；5910R 離心機（Eppendorf 公司）；IQ7000 純水儀（Milli-Q 公司）。

1.2 試藥

十二水合磷酸氫二鈉（批號20201106，國藥）；二水合磷酸二氫鈉（批號20201113，國藥）；氯化鈉（批號20201216，國藥）；TSKgel G3000 SWXL 色譜柱（批號022FA01848G，5 μm，7.8 mm × 300 mm，TOSOH 公司）；IAM（批號SLCC6164，Sigma 公司）；Maurice CE -SDS 應用試劑盒（批號88509，ProteinSimple 公司）（包含CE-SDS 實驗中涉及的SDS 樣品緩沖液，試液耗材）。

IgG4 型類似藥工作對照品（批號RS-001-20211201，用于方法開發(fā)和驗證）；注射液（批號20220101、20220303、20220305），均由南京正大天晴制藥有限公司提供。IgG4 型原研（emicizumab，羅氏。批號B3002B05、B3002B03、B4107B04）。

2 方法與結果

2.1 SE-HPLC 分析

設定流速為0.8 mL/min，采用流動相（100 mmol/L PB+200 mmol/L NaCl，pH 為6.8）通過色譜柱展開檢測分析。蛋白上樣量為20 μg，記錄22 min的采集峰圖，然后計算抗體純度。

SE-HPLC 檢測到了0.3%比例的高分子量物質，但未能將碎片與主峰分離。為了實現(xiàn)對純度的全面分析，還需借助CE-SDS 法進一步加以測定。

2.2 CE-SDS 的建立及優(yōu)化

2.2.1 初始方法

樣品制備：將工作對照品用超純水稀釋至4 mg/mL。取20 μL 稀釋后的溶液，將其與75 μL SDS樣品緩沖液和5 μL 250 mmol/L IAM 混勻后于70℃的條件下加熱10 min。冷卻至室溫后通過96 孔板后再次離心。

電泳分析：于4 600 V 下進樣20 s；分離為5 750 V 后維持60 min。樣品倉溫度為10 ℃，于220 nm 的檢測波長下進行檢測。采用面積歸一法計算抗體純度。

所有峰均在42 min 內(nèi)出峰。為提高檢測效率，將分離時間優(yōu)化至42 min。主峰信號值超出30～50 mAU 為儀器的最佳檢測范圍，需對檢測樣品的濃度進行調整。

2.2.2 檢測樣品終濃度的優(yōu)化

將工作對照品分別稀釋至質量濃度為2.5 mg/mL 和1.5 mg/mL，并參照2.2.1 的步驟制備檢測樣品。1.5 mg/mL 樣品組的主峰信號值在最佳范圍內(nèi)，因此優(yōu)化檢測樣品最終質量濃度為0.3 mg/mL。

檢測到1.5%的高分子量物質的存在。結合SEHPLC 排除抗體存在的可能性，推斷其是在制備過程中由游離巰基錯配產(chǎn)生的，需進一步優(yōu)化IAM 濃度以達到對游離巰基的完全封閉。

2.2.3 IAM 烷基化濃度的優(yōu)化

將250 mmol/L、500 mmol/L 和1 mol/L IAM 的烷基化能力進行對比，結果如圖1 所示。在IAM 的三種濃度下，高分子量物質的含量分別為1.5%、0.8%和0.2%。為提升封閉效果，將IAM 濃度優(yōu)化為1 mol/L。

圖1 IAM 烷基化濃度的優(yōu)化

2.2.4 加熱變性條件的優(yōu)化

抗體的加熱變性條件也需要優(yōu)化。在保證其完全變性的同時還需避免過度處理，以確保結果能得到真實反饋，具體需考慮加熱溫度和時長。

首先考察加熱溫度的影響。經(jīng)60 ℃處理后檢測到未完全變性的抗體峰，表明加熱溫度過于溫和。而80 ℃又過于劇烈，碎片含量顯著增加。因此選擇70℃作為變性溫度。

基于70 ℃加熱處理，進一步考察加熱時長的影響。處理5 min 時檢測到有未完全變性的抗體峰，15 min 時碎片峰含量顯著增加。經(jīng)對比，確定10 min 的加熱時長最佳，故選擇最適當?shù)淖冃詶l件為70℃下加熱處理10 min。

2.3 CE-SDS 的驗證

2.3.1 線性

將樣品稀釋至0.75～3 mg/mL（對應50%～200%的線性濃度點），制備檢測樣品并進行三次平行分析。主峰面積平均值Y（μv·s）對樣品質量濃度X（mg/mL）的回歸方程為：Y=6.613×108X+2.147×107。相關系數(shù)為R=0.999。且各點三次結果的抗體純度SRSD均不超過0.47%，表明該方法的線性范圍寬，靈敏度高。

2.3.2 精密度

實驗人員1 平行制備六份檢測樣品，抗體純度SRSD為0.20%，該方法具有良好的重復性。與實驗人員2 配制的六份樣品一起進行檢測，結果顯示十二次結果抗體純度的SRSD為0.23%，表明該方法的精密度良好。

2.3.3 溶液的穩(wěn)定性

檢測樣品于樣品倉中在10 ℃的條件下放置，分別在0 h、6 h、24 h、30 h、48 h 時進行進樣測定?？贵w純度無明顯差異，SRSD為0.09%。表明檢測樣品在10℃條件下放置，方法的檢測窗為48 h。

2.4 樣品檢測

SE-HPLC 檢測到emicizumab 和類似藥高分子量物質含量的范圍分別為0.2%～0.3%和0.4%～0.5%，均未檢測到碎片。CE-SDS 檢測到emicizumab高分子量物質和碎片的含量分別為0.3%～0.4%和1.3%～1.7%；而該方法下類似藥的對應含量分別為0.4%～0.6%和1.5%～1.7%。

經(jīng)過分析確定類似藥與原研emicizumab 在純度方面具有質量相似性，且進一步證實了CE-SDS用于碎片檢測的優(yōu)勢。

3 討論

抗體藥物質量的不均一性使研究者需要從多個維度對其進行質量分析。針對其純度特性，SEHPLC 的單一方法無法同步實現(xiàn)對高分子量物質和碎片的良好表征。而CE-SDS 作為基于不同原理的分離手段，在碎片分析上有著不可替代的優(yōu)勢。

根據(jù)抗體分子本身的差異和不同品牌毛細管電泳儀的區(qū)別，最適的CE-SDS 方法參數(shù)需優(yōu)化后才能確定。本研究針對IgG4 型生物類似藥，在Maurice電泳儀上建立了CE-SDS 檢測方法，并對一系列方法參數(shù)進行了優(yōu)化，還結合SE-HPLC 確定了初始條件下較高比例的高分子量物質是由游離巰基錯配產(chǎn)生的。經(jīng)驗證，該方法具有可實用性。

結合CE-SDS 和SE-HPLC 兩種方法評價類似藥與原研純度特性的相似性，表明CE-SDS 法可應用于放行和表征等研究中。

綜上所述，本文建立的方法適用于IgG4 型艾美賽珠單抗生物類似藥的純度分析，對于其他類似藥的純度分析也具有一定的參考意義。