楊潤蕾，張美如，高雪慧，汪 卓，張秀敏，2，3

1.河北大學生命科學學院，河北 保定 071000；2.河北省微生物育種與保育工程實驗室，河北 保定 071000；3.河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點實驗室，河北 保定 071000

枯草芽孢桿菌是最為常見的發(fā)酵菌株之一，其具有抗逆性強的特點，能夠分泌多種消化酶和有機酸，可以拮抗致病菌，改善飼料營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，而且經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵過的飼料也具有獨特的色、香、味，飼料適口性得到顯著改善[1]。

本試驗選用一株枯草芽孢桿菌對蛋雞配合飼料基礎(chǔ)料進行固態(tài)發(fā)酵，通過對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，提高發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶蛋白含量等指標，并探討發(fā)酵過程的規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵工藝，以期為進一步提高固態(tài)發(fā)酵飼料品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用的枯草芽孢桿菌菌株B591 為河北省微生物育種與保育工程實驗室分離并保存。

枯草芽孢桿菌活化采用NA 培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 15.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

NB 培養(yǎng)與NA 培養(yǎng)基配方相同，但不加瓊脂。

蛋雞配合飼料基礎(chǔ)料組成：玉米粉60%，豆粕25%，麩皮15%。

發(fā)酵基礎(chǔ)條件：添加硫酸銨2%，物料含水量40%，接種量1×109CFU/kg，初始pH 自然狀態(tài)（大約為6.6），發(fā)酵溫度為室溫（約23～27 ℃），發(fā)酵12 d。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

將枯草芽孢桿菌菌株B591 接種到NA 斜面培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)2 d，再接種到NB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)2 d。取種子液按照一定接種量接入固態(tài)發(fā)酵基料中。

1.2.2 單因素實驗

選取發(fā)酵時間（6、8、10、12、14 d）、發(fā)酵初始pH（6.0、6.5、7.0 和7.5）、料水比（1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8 和1∶0.9）、接種量（1.0×108CFU/kg、2.0×108CFU/kg、3.0×108CFU/kg、4.0×108CFU/kg、5.0×108CFU/kg）、硫酸銨添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）5 個因素分別開展單因素實驗。

1.2.3 正交試驗

通過上述單因素優(yōu)化試驗結(jié)果，以發(fā)酵時間A、接種量B 和物料含水量C、硫酸銨添加量D 為因素，每個因素設(shè)置3 個水平，進行L9（34）正交試驗設(shè)計（見表1）。

表1 L9（34）正交設(shè)計表

1.2.4 相關(guān)指標檢測

（1）枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的測定

取1.0 g 樣品加入99 mL 無菌水中，搖床振蕩20～30 min，梯度稀釋，于85 ℃下水浴20～30 min；取100 μL 稀釋后的樣品，涂布到NA 培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2 d 后計數(shù)。

（2）pH 的測定

稱取10.0 g 發(fā)酵飼料加到90 mL 蒸餾水中，振蕩30 min，靜置10 min 后，利用pH 計測定上清液的pH[2]。

（3）粗蛋白及酸溶蛋白含量的測定

取0.5 g 發(fā)酵飼料樣品加入消煮管中，采用凱氏定氮法測定飼料中的粗蛋白含量，具體測定方法詳見GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定》。取新鮮樣品3 g（精確至0.001 g），再加入25 mL 15%的三氯乙酸浸提4 h，10 000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清液于消煮管中[3]，采用凱氏定氮法測定飼料中酸溶蛋白含量，具體測定方法詳見NY/T 3801—2020《飼料原料中酸溶蛋白的測定》。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

各項指標測定均保證3 個樣品平行，試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019 和SPSS 軟件進行統(tǒng)計，用單因素方差分析（ANOVA）進行分析，組間多重比較采用Duncan's 分析進行差異顯著性檢驗，結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

分別在發(fā)酵2、4、6、8、10、12、14 d 時測定發(fā)酵料的pH、有效活菌數(shù)及酸溶蛋白/粗蛋白相對含量。發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前8 d，pH 下降得較快，到14 d 時pH為4.33。在發(fā)酵10 d 時，枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)達到最大值，為2.05×108CFU/g。酸溶蛋白/粗蛋白相對含量逐步上升，12 d 后上升逐漸趨于平緩，到14 d 時相對含量為32.69%。故選取發(fā)酵時間10、12、14 d 進行正交優(yōu)化。

2.1.2 發(fā)酵初始pH 對發(fā)酵的影響

發(fā)酵初始pH 為6.5 時，酸溶蛋白/粗蛋白相對含量最高，此pH 與物料自然pH 較為接近，便于進行發(fā)酵，故后續(xù)可選pH 自然狀態(tài)。

2.1.3 料水比對發(fā)酵的影響

在料水比為1∶0.6 時，酸溶蛋白/粗蛋白相對含量最高，隨著料水比的逐漸增大，酸溶蛋白/粗蛋白的相對含量逐漸下降。因此，選擇料水比1∶0.5、1∶0.6 和1∶0.7 為正交優(yōu)化的參數(shù)。

2.1.4 接種量對發(fā)酵的影響

選取接種量3×108CFU/kg、6×108CFU/kg、9×108CFU/kg 進行正交優(yōu)化。

2.1.5 硫酸銨添加量對發(fā)酵的影響

在硫酸銨添加量為2%時，酸溶蛋白/粗蛋白相對含量最高，故選擇硫酸銨添加量1.5%、2%和2.5%為正交優(yōu)化的參數(shù)。

2.2 正交優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)表1 設(shè)計的正交條件開展正交實驗，測定各實驗條件下的酸溶蛋白/粗蛋白相對含量，結(jié)果見表2。

表2 正交優(yōu)化結(jié)果

由表2 可知，極差RA>RD>RC>RB，即4 個因素中，發(fā)酵時間對酸溶蛋白/粗蛋白相對含量的影響最大，其次為硫酸銨添加量和料水比，接種量影響較小。故最優(yōu)條件為A3B2C1D3，即發(fā)酵時間為14 d，接種量為6×108CFU/kg，料水比為1∶0.5，硫酸銨添加量為2.5%。

在上述優(yōu)化發(fā)酵條件下發(fā)酵14 d 后，取樣測定發(fā)酵基料和發(fā)酵飼料的各指標見表3。相較于發(fā)酵基料，發(fā)酵后飼料的pH 顯著降低，枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)可達到1829×108CFU/kg，酸溶蛋白/粗蛋白含量達到33.66%。

表3 優(yōu)化發(fā)酵條件下的發(fā)酵基料和發(fā)酵飼料比較

3 討論

經(jīng)過發(fā)酵后，發(fā)酵飼料中產(chǎn)生了乳酸、乙酸等多種有機酸，使物料pH 顯著降低，從而抑制了真菌的生長，同時使發(fā)酵飼料具有酸香味，可以改善飼料的適口性，提高動物的采食率，還可在進入動物腸道后降低腸道環(huán)境pH，抑制有害菌的生長，提高動物健康水平[4]。本研究中經(jīng)過發(fā)酵的飼料pH 明顯降低。

本研究中酸溶蛋白/粗蛋白相對含量顯著提高，一方面是因為飼料中的非蛋白氮可以轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)；另一方面是飼料中的非蛋白物質(zhì)出現(xiàn)損耗，蛋白質(zhì)在飼料中的百分比得到提高[5]。

4 結(jié)語

通過對枯草芽孢桿菌B591 對蛋雞配合飼料基礎(chǔ)料固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間為14 d，接種量為6×108CFU/kg，料水比為1∶0.5，硫酸銨添加量為2.5%；并測定了優(yōu)化發(fā)酵條件下的發(fā)酵飼料質(zhì)量，可知pH 顯著降低，有效活菌數(shù)可達到1.83×1011CFU/kg，酸溶蛋白/粗蛋白含量達到33.66%。