何俊淅

成都仁天醫(yī)療器械有限公司，四川 成都 610074

止血是醫(yī)療和急救中的一個(gè)重要步驟，尤其是在手術(shù)中和有創(chuàng)傷等情況下，其本身也是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[1]。目前，新型止血材料的研發(fā)和應(yīng)用備受關(guān)注，市面上對(duì)更有效、安全且便于使用的止血材料的需求也在逐漸增加，有些材料不僅能止血，還有防粘連的效果[2]。新型止血材料有多孔沸石[3]、多肽基止血材料、多糖/多肽復(fù)合止血材料等[4]，其中多糖類(lèi)止血材料又包含很多種類(lèi)，例如纖維素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽、羧甲基纖維素鈉等[5]。

多聚糖中的止血淀粉是一種具有生物相容性且可生物降解的材料，在止血和促進(jìn)傷口愈合方面展示出了巨大的潛力。許多研究人員通過(guò)改變淀粉結(jié)構(gòu)、功能化和修飾等方法，改善了其性能，進(jìn)一步提高了其止血和促進(jìn)傷口愈合的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大耳兔（成都達(dá)碩生物科技有限公司），雌雄各半，重量為1.9～2.1 kg。

健康成年SD 大鼠（成都達(dá)碩生物科技有限公司），雄性，體重在210～240 g 之間。

1.2 儀器、試劑與樣品

儀器：60 mm 布氏漏斗、5 μm 孔徑濾紙（武漢杰絲曼新材料有限公司）、抽濾瓶、真空泵、光學(xué)顯微鏡Motic BA400、752 型分光光度計(jì)、勻漿儀等。

主要試劑：羧甲基淀粉鈉（廣東云門(mén)生物技術(shù)有限公司），環(huán)氧氯丙烷、乙酸乙酯、氯化鈉、硫酸鈉、氫氧化鈉、硼氫化鈉、span-80、植物油采購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司，自制復(fù)配碘溶液（含0.33%碘和0.66%碘化鉀）、含0.3%的檸檬酸兔子血液10 mL，共3 組。

實(shí)驗(yàn)組：自制淀粉止血材料，白色粉末。

對(duì)照組1：馬鈴薯淀粉（食品級(jí)），品牌：奈倫。

對(duì)照組2：進(jìn)口止血材料“Arista”，規(guī)格：SM0002（3.0 g）、批號(hào)：5729901，生產(chǎn)方：Medafor，Inc，注冊(cè)證書(shū)編號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2012 第3640091 號(hào)（更）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料制備

①稱(chēng)取羧甲基淀粉4 g、硫酸鈉6 g、氫氧化鈉0.2 g、硼氫化鈉0.2 g，倒入28 g 蒸餾水中攪拌溶解。

②稱(chēng)取1.3 g 的span-80 和53 g 大豆油在50℃條件下攪拌乳化均勻，攪拌器轉(zhuǎn)速為600 r/min。

③將步驟①制得的淀粉乳液倒入步驟②制備的油相中攪拌均勻。

④加入1.8 mL 環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)5 h。

⑤向反應(yīng)完的溶液中加入乙酸乙酯與飽和氯化鈉靜置分層。

⑥取下層產(chǎn)物并抽濾用純化水清洗至中性。

⑦使用乙醇脫水2 次。

⑧60 ℃環(huán)境中烘干即得產(chǎn)物。

1.3.2 體外凝血觀察及吸水率測(cè)試

吸水率測(cè)試中，將淀粉吸水至飽和，然后使用抽濾裝置抽出多余水分，最后計(jì)算吸水率。吸水率按照式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：Ws為吸取水分后的質(zhì)量；Wi為初始質(zhì)量。

1.3.3 降解研究

基于碘液和實(shí)驗(yàn)組改性淀粉的顯色反應(yīng)原理，其反應(yīng)產(chǎn)物呈深藍(lán)色。使用紫外分光光度計(jì)可以準(zhǔn)確測(cè)定淀粉的濃度并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下。

將健康SD 大鼠隨機(jī)分為3 組：30 min、60 min和120 min 組，每組10 只。具體試驗(yàn)步驟如下。

①按照30 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)健康SD 大鼠用3%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行腹腔注射麻醉；

②對(duì)腹部進(jìn)行消毒，切口約為0.5 cm，注入40 μL 濃度為20%的止血淀粉溶液后縫合；

③標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：將止血淀粉分別配制成質(zhì)量濃度為0.05～1.6 μg/mL 的溶液，取2 mL 該溶液向其中加入0.1 mL 碘溶液，充分混勻后立即使用752型分光光度計(jì)在610 nm 處測(cè)定吸光度（A 值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；

④分別于注射后30 min、60 min 和120 min 用4 mL0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗腹腔，收集沖洗液；

⑤吸取沖洗液2 mL，向其中滴入0.1 mL 碘溶液，充分混勻后測(cè)定其吸光度（A 值）；

⑥根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到殘留的止血淀粉的含量。

體外降解實(shí)驗(yàn)：

將健康SD 大鼠隨機(jī)分為4 組：肝臟組、腎臟組、內(nèi)皮組、肌肉組，每組各10 只，從各分組中各取1 g 組織，進(jìn)行體外試驗(yàn)。具體操作步驟如下：①將健康SD 大鼠麻醉后無(wú)菌操作取出肝、腎、肺及肌肉組織各1 g，放入4 mL0.9%氯化鈉溶液中，在冰塊中勻漿；②在4 ℃、3 000 r/min 的條件下離心15 min；③取上清液加入2 μg 止血淀粉，混勻后37 ℃水浴30 min；④取2 mL 水浴后的標(biāo)本，向其中加入0.1 mL 碘溶液，充分混勻后測(cè)定其吸光度（A 值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算止血淀粉的殘留率。

1.3.4 止血實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2 進(jìn)行對(duì)比，使用新西蘭大耳兔模型，分別選擇皮下出血模型（毛細(xì)管）、肝臟出血模型（靜脈）、股動(dòng)脈出血模型（動(dòng)脈）三個(gè)模型開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，如表1 所示。

表1 動(dòng)物分組表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 形貌

在體外凝血效果實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組淀粉顆粒吸水后膨脹形成了更大的顆粒，透明度也變得更高了，其余血細(xì)胞（紅色部分）被阻擋在顆粒外部，導(dǎo)致血液變得更黏稠了。在發(fā)生促凝的級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)，可以用更少的時(shí)間形成纖維蛋白網(wǎng)，達(dá)到提前凝固的效果。在三種樣品吸水率最低是對(duì)照組1，僅為233%，最高的是實(shí)驗(yàn)組，高達(dá)1 195%，居中的是對(duì)照組2 的797%（如圖1 和圖2）。

圖1 改性后的樣品電子掃描顯微鏡100 倍放大圖

圖2 改性后的樣品電子掃描顯微鏡500 倍放大圖

2.2 降解實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)大鼠體內(nèi)和體外的降解速度進(jìn)行了研究，在體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組在2 h 的植入時(shí)間內(nèi)就降解到了2%以下，降解速度較快；而在體外降解實(shí)驗(yàn)中，在淀粉和組織液混勻0.5 h 后，肝臟組織降解得最多，只剩15%左右了。

體內(nèi)降解結(jié)果：淀粉在植入大鼠腹腔中后，呈現(xiàn)出了快速降解的趨勢(shì)，如表2 所示。植入30 min 后，10 只大鼠的平均殘留量只剩下了58.522%，1 h 后降至34.599%，2 h 后的殘余量?jī)H為1.461%。

表2 大鼠腹腔內(nèi)實(shí)驗(yàn)組殘留含量

體外降解結(jié)果：通過(guò)對(duì)10 只大鼠的組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出其降解速度為：肝臟>內(nèi)皮>肌肉>腎臟。在30 min 的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，肝臟降解到了15%左右，腎臟也降到了50%以下。

2.3 止血實(shí)驗(yàn)

2.3.1 皮下出血模型

新西蘭大耳兔皮下出血模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組2 相比，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組2 的止血時(shí)間快了46.58%。

2.3.2 肝臟出血模型

新西蘭大耳兔肝臟出血模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組2 相比，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組2 的止血時(shí)間快了13.2%。

2.3.3 股動(dòng)脈出血模型

與對(duì)照組2 相比，實(shí)驗(yàn)組止血更快，平均時(shí)間為55.6 秒，比對(duì)照組2 的止血時(shí)間快了46.8%，節(jié)省了將近一半的止血時(shí)間。

3 討論

體內(nèi)降解實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，止血粉的代謝速度較快，在2 h 內(nèi)殘留量就降到了2%以下。該結(jié)果說(shuō)明止血粉在體內(nèi)新陳代謝的作用下，能實(shí)現(xiàn)快速降解，而2 h 的存留時(shí)間也完全能滿(mǎn)足一般劑量血液自身的凝血反應(yīng)。通過(guò)體外降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果30 min 的降解數(shù)據(jù)可以看出，止血粉在不同組織中的代謝速度也不同，其中代謝速度最快的組織為肝臟。

在整個(gè)止血模型實(shí)驗(yàn)中，與進(jìn)口產(chǎn)品的對(duì)照組2 相比，三組實(shí)驗(yàn)都表明實(shí)驗(yàn)組具有更強(qiáng)的止血效果。所以相同情況下，吸水比例越大的產(chǎn)品，止血性能越出眾，所需要的凝血時(shí)間就越短。

在皮下出血模型中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2 經(jīng)過(guò)7 d 的恢復(fù)期后，皮下組織的恢復(fù)狀態(tài)也有所不同?？梢钥闯鰧?shí)驗(yàn)組恢復(fù)得較好，對(duì)照組2 的模型部位還未完全恢復(fù)。這可能是因?yàn)閷?duì)照組2 在使用止血粉后，其損傷部位的血液未能完全凝固，還處于內(nèi)出血狀態(tài)，所以推遲了恢復(fù)期。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)對(duì)具有大吸水率的羧甲基淀粉鈉進(jìn)行改性，得到了具有更大比表面積的吸水率高的淀粉顆粒。動(dòng)物的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明該改性樣品凝血更快；在皮下止血實(shí)驗(yàn)中，可以觀察到實(shí)驗(yàn)組的組織狀態(tài)也恢復(fù)得比較好。在動(dòng)脈止血實(shí)驗(yàn)中使用止血粉壓迫止血，實(shí)驗(yàn)組止血更快，為其他研究者制備止血產(chǎn)品提供了一定的參考。