陳小宜，鄧 璇，樊 輝，齊風(fēng)佩

湖南城市學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413000

1 緒論

過(guò)氧化氫（H2O2）是生物體內(nèi)維持生理平衡的使者，適量的H2O2可以發(fā)揮抗氧化作用，起到保護(hù)細(xì)胞的功能，同時(shí)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的呼吸過(guò)程和白細(xì)胞的活動(dòng)，參與抗病毒和抗細(xì)菌的過(guò)程；然而過(guò)量的H2O2會(huì)引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA 等生物分子的氧化損耗和細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致癌癥等各類(lèi)疾病的發(fā)生[1-2]。因此，設(shè)計(jì)合成一種能夠快速檢測(cè)生理?xiàng)l件下H2O2濃度的熒光探針無(wú)論在醫(yī)學(xué)還是檢驗(yàn)方面都具有極高的研究?jī)r(jià)值[3-4]。

常見(jiàn)的檢測(cè)H2O2的方法有熒光探針?lè)?、高效液相色譜，紫外-可見(jiàn)吸收檢測(cè)法、分光光度法、電化學(xué)方法、電子自旋共振法和質(zhì)譜法等。熒光探針?lè)ㄒ虿僮鬏^為簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快、檢測(cè)效果準(zhǔn)確、對(duì)生物體傷害小等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[5-7]。

花菁染料是科學(xué)家G.WiLLiams 于19 世紀(jì)60年代首次發(fā)現(xiàn)，并且因其似“玉米淀粉”藍(lán)色而被命名為“花菁”[8-9]。它是一種發(fā)色團(tuán)共軛體子兩端建立在N-N 原子間的多甲川染料的衍生物。本文合成了一種類(lèi)花菁的含苯并噻唑的熒光探針，并簡(jiǎn)單研究了探針對(duì)H2O2的相應(yīng)情況。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AAA（上海嘉鵬科技有限公司）；真空干燥箱DZ-2BCIV（天津市泰斯特儀器有限公司）；熒光分光光度計(jì)F-4600（日立公司）；紫外-科技分光光度計(jì)U-3010（日立公司）；三用紫外分析儀ZF7（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；核磁共振儀Avance Neo（400MHz，Bruker）。所用試劑都為分析純。

2.2 目標(biāo)探針的合成

目標(biāo)探針的合成路線見(jiàn)圖1。稱(chēng)取0.119 6 g 3，5-二醛基-4-羥基苯甲酸乙酯（0.008 8 mol）和0.199 4 g 2，3-二甲基苯并噻唑碘化物（0.001 2 mol）于50 mL 圓底燒瓶中，加入10 mL 乙醇，并加入3 滴催化劑哌啶，加熱80 ℃反應(yīng)24 h，旋干，柱層析提純（二氯甲烷∶甲醇=25∶1，V/V），得到紅色固體2（0.228 4 g，產(chǎn)率36.45%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：8.51（s，2H），8.12（s，2H），7.88（s，2H），7.30（s，2H），7.15（s，2H），6.99（s，2H），6.73（s，2H），4.52（s，6H），4.36（q，J=7.1 Hz，2H），1.37（t，J=7.1 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：14.8，43.5，63.7，104.3，116.8，120.2，123.3，125.6，127.2，129.9，132.1，134.1，136.3，139.2，141.2，158.9，161.1，175.4。

圖1 目標(biāo)探針的合成路線

稱(chēng)取0.243 9 g 化合物3 和0.240 7 g 催化劑碳酸銫于50 mL 圓底燒瓶中，加入15 mL 丙酮將其溶解，得到紅色溶液，35 ℃下加熱攪拌反應(yīng)1 h 后，再加入0.59 g 4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯；待TLC 檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，旋干，柱層析提純，展開(kāi)劑為二氯甲烷：甲醇=25∶1（V/V），得到目標(biāo)探針（0.062 7 g，產(chǎn)率4.29%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：8.65 （s，2H），8.23 （s，2H），7.94 （s，2H），7.55（s，6H），7.35（s，2H），7.32（s，2H），7.17（s，2H），6.95（s，2H），6.78（s，2H），6.15（s，2H），4.55（s，6H），4.38（q，J=7.2 Hz，2H），1.34（t，J=7.2 Hz，3H），1.32（s，12H）。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6），δ（ppm）：14.8，43.5，64.7，85.6，104.3，116.8，120.2，123.3，125.6，127.2，129.9，132.1，134.1，136.3，139.2，141.2，158.9，161.1，175.4。

2.3 熒光光譜測(cè)試

熒光光譜檢測(cè)條件：Ex=10.0 nm，Em=10.0 nm，U=700 V。探針最終濃度為10 μmol/L。使用熒光光譜儀分別測(cè)試探針在不同二甲亞砜：PBS 比例、不同丙三醇含量（黏度不同）條件下的熒光光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針在不同比例的二甲亞砜和PBS 溶液下的熒光光譜

探針在不同比例的DMSO-PBS 體系中的熒光強(qiáng)度如圖2 所示。在二甲亞砜∶PBS=1∶9 時(shí)，探針熒光強(qiáng)度最低；隨著二甲亞砜的含量逐步增多，探針的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；當(dāng)二甲亞砜∶PBS=7∶3 時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高。為了更好地模擬生物體環(huán)境，在保證檢測(cè)效果的前提下，應(yīng)該選擇PBS 含量盡量多一點(diǎn)的DMSO-PBS 體系。所以該實(shí)驗(yàn)最終選擇二甲亞砜∶PBS=7∶3 的DMSO-PBS 體系。

圖2 探針在不同比例的DMSO-PBS 體系中的熒光光譜

3.2 探針對(duì)黏度的熒光響應(yīng)

配置不同比例（0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）的DMSO∶丙三醇溶液進(jìn)行熒光檢測(cè)。如圖3 所示，隨著添加的丙三醇比例越來(lái)越大，溶液黏度逐漸增大，TICT 效應(yīng)逐漸減弱，所以探針的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。因此，探針熒光強(qiáng)度會(huì)隨著黏度的增大而增強(qiáng)，且探針的熒光強(qiáng)度與丙三醇的比例變化呈線性關(guān)系。

圖3 探針在不同黏度下的熒光強(qiáng)度變化

3.3 探針對(duì)不同濃度過(guò)氧化氫的響應(yīng)

在DMSO-PBS 混合體系（pH 7.4，7∶3，V/V）中探究探針對(duì)不同濃度H2O2的響應(yīng)情況（圖4）。H2O2能與探針中的苯硼酸識(shí)別單元反應(yīng)使其氧化為酚羥基，探針還原成花菁染料化合物4，化合物4 也可與H2O2反應(yīng)，從而使化合物8 的熒光減弱，所以該實(shí)驗(yàn)的熒光強(qiáng)度一直減弱。由圖4 可知，探針在520 nm 處的熒光發(fā)射強(qiáng)度與過(guò)氧化氫濃度在0～150 μmol/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

圖4 探針和不同濃度過(guò)氧化氫反應(yīng)熒光光譜

4 結(jié)論

本文通過(guò)三步反應(yīng)合成了一種能夠檢測(cè)H2O2的苯并噻唑類(lèi)熒光探針，并研究了該探針在不同溶劑、H2O2濃度、黏度條件下檢測(cè)H2O2的響應(yīng)。結(jié)果表明，目標(biāo)探針對(duì)H2O2響應(yīng)的最佳條件為：二甲亞砜作溶劑、反應(yīng)體系為DMSO-PBS（7∶3，V/V）體系；探針的熒光強(qiáng)度隨著丙三醇的逐漸增多而逐漸增強(qiáng)；探針對(duì)H2O2響應(yīng)為：當(dāng)H2O2濃度在0～150 μmol/L 之間時(shí)，探針的熒光強(qiáng)度與H2O2濃度呈良好的線性關(guān)系，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到150 μmol/L 時(shí)，探針熒光強(qiáng)度達(dá)到基本穩(wěn)定狀態(tài)。