蘭 馨

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

1 緒論

1.1 蘆葦簡(jiǎn)介

1.1.1 蘆葦

蘆葦是禾本科多年生水生植物，隸屬于禾本目禾本科的蘆竹亞科蘆葦屬，在世界各大洲內(nèi)分布廣泛。蘆葦倍性十分復(fù)雜，生態(tài)型眾多，遺傳資源豐富，具有很強(qiáng)的研究和應(yīng)用價(jià)值。

1.1.2 蘆葦生態(tài)型

蘆葦?shù)臓I(yíng)養(yǎng)繁殖能力極強(qiáng)，是典型的無(wú)性系植物。其生態(tài)幅極廣，可在各種淺水濕地中形成密集的單優(yōu)群落，甚至有些品種的蘆葦在荒漠和鹽堿地也能廣泛生存[1]。因此，蘆葦是研究倍性、基因表達(dá)和植物性狀的理想模式物種。

1.1.3 蘆葦品種化

根據(jù)《中國(guó)植物志》記載，蘆葦廣布在南北半球的溫帶地區(qū)，是蘆葦屬中分布最為廣泛的物種，并且其染色體倍性復(fù)雜，表型和遺傳多態(tài)性高。但蘆葦種內(nèi)不同株系之間的分類關(guān)系并不清楚，無(wú)法表征其多樣的表型[2]。蘆葦品種化鑒定是蘆葦研究中十分重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，運(yùn)用簡(jiǎn)便、快速的鑒定方法鑒定出植株的品種，可以大大減少工作量，降低成本，加快研究進(jìn)程，對(duì)蘆葦研究具有重要意義。

1.2 LEA 研究現(xiàn)狀

1.2.1 LEA 起源

Dure 等[3]在棉花胚胎子葉中分離得到一組高表達(dá)的mRNA，將其命名為lea mRNA，同時(shí)獲取了其表達(dá)蛋白。該蛋白在棉花種子成熟后期大量積累，同時(shí)保護(hù)組織細(xì)胞在種子成熟過(guò)程中不被脫水脅迫傷害，于是該蛋白被命名為胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA 蛋白）。當(dāng)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)，LEA 蛋白在種子發(fā)育晚期大量積累；當(dāng)植物受逆境脅迫時(shí)，LEA基因也可以在其他組織中表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗逆能力。

1.2.2 LEA 蛋白分類

LEA 蛋白在植物中廣泛存在。隨著關(guān)于LEA 蛋白的研究越來(lái)越多，LEA 蛋白的分類標(biāo)準(zhǔn)也發(fā)生變化。目前一般將LEA 蛋白家族分為8 個(gè)亞家族，即LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、LEA_6/PvLEA18、脫水素（DHN）和種子成熟蛋白（SMP）[4]。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的日益成熟，多個(gè)物種的LEA基因家族已在全基因組水平上進(jìn)行了分析鑒定，如在擬南芥中鑒定到51 個(gè)LEA 基因[3]，小麥中鑒定到179 個(gè)LEA 基因[5]，高粱中鑒定到35 個(gè)LEA 基因，玉米中鑒定到83 個(gè)LEA 基因[3]，大白菜中鑒定到65 個(gè)LEA 基因[6]。

1.2.3 蘆葦LEA 基因家族研究現(xiàn)狀

張茜[2]通過(guò)擬南芥中51 個(gè)LEA 基因的蛋白序列，在實(shí)驗(yàn)室自建的三個(gè)蘆葦?shù)鞍讕?kù)，即蘆葦融合蛋白庫(kù)（All，A）、沼澤蘆葦?shù)鞍讕?kù)（SR，S）和沙丘蘆葦?shù)鞍讕?kù)（DR，D）中進(jìn)行搜庫(kù)，運(yùn)用極大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將蘆葦LEA 蛋白序列分為7 簇，分別是LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、Dehydrin、SMP 和PvLEA18（LEA_6）。

1.2.4 LEA 基因

在蘆葦基因組中篩選出136 個(gè)LEA 基因家族成員，其中LEA_1 亞組中有4 個(gè)成員，LEA_2 亞組中有104 個(gè)成員，LEA_3 亞組中有9 個(gè)成員，LEA_4亞組有3 個(gè)成員，LEA_5 亞組中有2 個(gè)成員，DHN亞組中有8 個(gè)成員，SMP 亞組中有6 個(gè)成員。

1.3 研究目的

本研究旨在研究不同生境下蘆葦細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)及LEA 蛋白表達(dá)差異，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，得出二者對(duì)蘆葦細(xì)胞抗逆性的影響和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，從而推進(jìn)蘆葦凈化水質(zhì)以及提高其他植物抗逆能力的生產(chǎn)生活應(yīng)用。

2 蘆葦LEA 蛋白基因

2.1 LEA 蛋白采樣篩選區(qū)域

對(duì)玉淵潭6 個(gè)不同位置的蘆葦進(jìn)行采樣，每個(gè)位置采集3 株蘆葦?shù)娜~片，并將其分別儲(chǔ)存到-70℃的冰箱中。

2.2 蘆葦LEA 基因選取

張茜針對(duì)蘆葦融合數(shù)據(jù)庫(kù)（ALL）中找到的48個(gè)LEA 基因，在四倍體和八倍體蘆葦中開展N + P響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)如下結(jié)果。

在蘆葦中發(fā)現(xiàn)77 條編碼LEA 蛋白家族的基因，其中3 個(gè)LEA_2（PB.12079.1，PB.7780.1 and PB.49.1）和2 個(gè)脫水素（PB.2879.1 and PB.8282.1），其轉(zhuǎn)錄水平在蘆葦四倍體中明顯低于八倍體。意外的是，有一個(gè)基因（LEA_1PB.10905.1）在四倍體中的表達(dá)量高于八倍體。這可能會(huì)成為一種在轉(zhuǎn)錄水平上分辨蘆葦染色體組倍性的新方法[2]。

因此，可以利用此6 個(gè)基因作為具有明顯差異的蘆葦LEA 基因，并將其作為模板設(shè)計(jì)引物。

2.3 RT-PCR 半定量分析

2.3.1RT-PCR 結(jié)果分析

相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)

使用NCBI 引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站導(dǎo)入目的基因，選取TM 值在55 左右，F(xiàn)、R 差距在3 以內(nèi)，引物互補(bǔ)且特異性好的6 種引物（如圖1 所示）。

圖1 導(dǎo)入的6 種相關(guān)基因引物

2.3.2 PCR 結(jié)果及分析（圖2）

圖2 凝膠掃描圖像結(jié)果

其中，4×、8×分別表示蘆葦?shù)乃谋扼w和八倍體，1～6 分別為在玉淵潭6 個(gè)位置進(jìn)行的采樣。

由圖可見(jiàn)，可通過(guò)樣本獲得的清晰多態(tài)性條帶，將6 種不同的蘆葦樣本進(jìn)行分類，并根據(jù)條帶的分布位置確定是哪一種蘆葦樣本，具有一定的區(qū)分度。PB.2879.1 所顯示的條帶在材料3、4、5、6 中有所表達(dá)，在其他材料中的表達(dá)較少，且2 在此基因中表達(dá)也是最少的。PB.7780.1 的上帶在4×、8×中表達(dá)較少，在1、2、3、4、5、6 中表達(dá)量逐漸增加，其中在3、5、6 中表達(dá)最多；而PB.7780.1 的下帶則與之相反，在4×、8×、1、2 中表達(dá)量較多，而在3、4、5、6 中幾乎不表達(dá)。PB.12079.1 在4×、8×中表達(dá)量較少，在1、2、3、4、5、6 中表達(dá)量高于4×、8×且?guī)缀鯚o(wú)差異。

PB.8282.1 和PB.10905.1 表達(dá)量較高且?guī)缀鯚o(wú)差異。

實(shí)驗(yàn)中的PB.7780.1 出現(xiàn)了兩條較為明顯的條帶，推測(cè)是因?yàn)楸４嫣幚聿划?dāng)而導(dǎo)致DNA 降解，因此在日后實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意DNA 的保存問(wèn)題并提高點(diǎn)樣的準(zhǔn)確性，以減少一定的操作性誤差。

3 結(jié)論

綜上，所有蘆葦LEA 蛋白的蛋白序列長(zhǎng)度在69～455 個(gè)氨基酸之間，分子質(zhì)量在7.38～49.47 kDa之間，理論等電點(diǎn)在4.25～11.22 之間；疏水性蛋白多集中在LEA_2 家族中；有57 個(gè)蘆葦LEA 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40；脂肪族指數(shù)在26.91～130.77 之間。

選取的基因后續(xù)通過(guò)RT-PCR 進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證，4×和8×材料由于倍性變化導(dǎo)致其與自然生境下的蘆葦材料表達(dá)量有所差異，因此可利用其中差異較大的PB.12079.1、PB.2879.1、PB.10905.1 來(lái)對(duì)未知蘆葦判斷其倍性是否變化，其具體原因有待進(jìn)一步深入研究。