李奇,薛堅,張泓

1. 上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院檢驗科,上海 200062; 2. 上海市金山區(qū)眾仁老年護理醫(yī)院檢驗科,上海 201501

耐碳青霉烯腸桿菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae, CRE)是臨床上常見的多重耐藥菌,在醫(yī)院環(huán)境中可以通過人物間或人際間的直接接觸發(fā)生播散或轉(zhuǎn)移定植[1]。攜帶CRE的患者可能成為醫(yī)院內(nèi)CRE的傳播來源,盡早發(fā)現(xiàn)CRE有助于更好地預防和控制,因此2015年以來國內(nèi)外多項指南建議對易感染CRE的高風險人群開展CRE定植的主動篩查,并建議將腸道標本作為篩查的優(yōu)選標本[2]。老年護理醫(yī)院的絕大部分患者具有住院時間長、高齡、深度的免疫衰老或伴有多種慢性疾病等臨床特點,是易感染CRE的高風險人群[3]。近年來在綜合性醫(yī)院中對易發(fā)生CRE感染患者開展CRE腸道定植的研究較多,對老年護理醫(yī)院住院患者腸道CRE的攜帶情況研究較少。本課題以主動篩查的方式對老年護理醫(yī)院長期住院者腸道CRE的攜帶情況進行探討,了解CRE腸道攜帶者的比例、臨床特征以及CRE的分子特征,為進一步的控制干預措施提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料于2021年4月依據(jù)入選標準隨機選取上海市金山區(qū)眾仁老年護理醫(yī)院220位60歲及以上長期住院者(住院時間≥90d)作為研究對象,收集相關病史資料,其中女性143位,男性77位,平均年齡(84.79±7.57)歲,平均住院時間為1 100.47 d。入選標準:(1)年齡≥60歲,住院時間≥3個月; (2)能自主排便; (3)入組患者采樣前無腸道感染癥狀。所有研究均在醫(yī)院倫理委員會的批準下進行(倫理批號:202007)。

1.2采集樣本類型和頻率首次采樣在2021年4月2日全部完成,計劃采集3次,隔1周采集1次,主要采集納入患者的糞便樣本,對于當日無糞便的患者則采集肛拭子樣本[4]。若患者送檢樣本中檢測出CRE,則判斷該患者腸道有CRE攜帶,不再進行后續(xù)采樣;若患者3次采集的糞便樣本中均未發(fā)現(xiàn)CRE,則判斷該患者腸道無CRE攜帶。

1.3儀器與試劑全自動細菌鑒定分析儀為VITEK-2 compact(法國生物梅里埃公司),鑒定卡為配套的GN卡;藥敏紙片亞胺培南、美羅培南的品牌為OXOID;M-H培養(yǎng)基和CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基購自于上?？片敿挝⑸锟萍加邢薰? APB和EDTA試劑購自于珠海迪爾生物工程有限公司,所有試劑均在有效期內(nèi)。陰性質(zhì)控菌株ATCC25922來源于上海市臨床檢驗中心,陽性質(zhì)控菌株是經(jīng)基因測序的KPC-2型肺炎克雷伯菌臨床株。

1.4方法

1.4.1 CRE的篩查 (1)大便標本的采集和運送 按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)》要求進行。(2)CRE的篩選 將大便樣本接種于CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基,于35 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h。依據(jù)CHROMagar KPC顯色培養(yǎng)基使用說明書,將疑似CRE挑出并純化,培養(yǎng)18～24 h后使用接種環(huán)挑取少許菌落置入含有1.5 mL胰大豆腦心浸液的菌株保存管中并混勻,隨后放置在-22 ℃冷凍冰箱種保存。

1.4.2 CRE的鑒定與復核 菌株的鑒定 將冷凍保存的菌液恢復至室溫,從中吸取200 μL轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂平板,培養(yǎng)18～24 h。使用儀器VITEK-2 Compact配套的GN卡進行菌種的鑒定。對鑒定為腸桿菌科的細菌,采用K-B法測定該菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥性,若對任意一種藥物表現(xiàn)為耐藥,則認為該菌為CRE。體外藥敏試驗折點的判斷依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(clinicaland laboratory standardInstitute, CLSI)2022年M100文件[5]。

1.4.3 CRE耐碳青霉類藥物表型檢測 采用碳青霉烯酶抑制增強實驗檢測CRE耐碳青霉類藥物表型,具體操作見參照文獻[6]。產(chǎn)A類碳青霉烯酶:含APB的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 m;產(chǎn)B類碳青霉烯酶:含EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm;同時產(chǎn)A類碳青霉烯酶和B類金屬酶:同時含APB和EDTA的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥紙片相差≥5 mm;不產(chǎn)A類或B類碳青霉烯酶:含酶抑制劑的亞胺培南紙片抑菌圈直徑與單藥相差均<5 mm。

1.4.4 產(chǎn)碳青酶烯酶基因檢測 使用PCR檢測CRE常見的5種產(chǎn)碳氫酶烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48),將分純后的菌株送至上海派森諾生物科技有限公司進行PCR實驗、凝膠電泳和基因測序,測序結(jié)果在NCBI上比對以確定基因型。PCR反應體系為25 μL:MIX液12.5 μL、模板2 μL、引物上下游各1 μL、雙蒸水8.5 μL,反應條件設置為94 ℃預變性5min, 94 ℃變性 60S,退火30 S, 72 ℃延伸60 S,總共循環(huán)數(shù)為35個(退火溫度和引物序列見下表1)。

表1 5種耐藥基因PCR實驗引物相關信息

2 結(jié)果

2.1腸道攜帶CRE的篩檢結(jié)果220位患者中腸道CRE攜帶者的所占比為8.18%(18/220)。第1批次送檢的220份糞便樣本中,18份糞便樣本中篩查出CRE;第2批次和第3批次202位無腸道CRE攜帶者的糞便樣本中均未檢測出CRE。在菌群分布上以CR-ECO為主,其所占比為50.00%(9/18);其次為CR-KPN,所占比33.33%(6/18),耐碳青霉烯陰溝腸桿菌(CR-ECL)2株,所占比為11.11%,耐碳青霉烯枸櫞酸桿菌(CR-CFR)1株,所占比為5.56%,具體的篩檢結(jié)果見表2。

表2 腸道攜帶CRE的篩檢結(jié)果

2.2碳青霉烯酶表型及基因檢測結(jié)果18株CRE均是產(chǎn)碳青霉烯酶CRE(CPE),碳青霉烯酶抑制增強實驗顯示11株CRE表達B類酶,所占比61.11%; 7株CRE表達A類酶,所占比為38.89%。在表達B類酶的菌株中, 7株為CR-ECO,所占比為63.64%;在表達A類酶的菌株中, 5株為CR-KPN,所占比為71.43%。分離的CR-KPN以產(chǎn)KPC(83.33%)為主, CR-ECO以產(chǎn)NDM(77.78%)為主。18株CRE中檢測出2種碳青霉烯酶基因, 11株檢測出blaNDM,檢出率為61.11%;7株檢測出blaKPC,檢出率為38.89%,blaVIM、blaOXA-48和blaIMP均未檢測出。

測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站BLAST比對,發(fā)現(xiàn)blaKPC的基因型均為blakpc-2型,而blaNDM有blaNDM-1和blaNDM-5兩種亞型,blaNDM-1有8株,是主要的blaNDM亞型,同時blaNDM-5有3株,均被CR-ECO攜帶,具體的研究數(shù)據(jù)見圖1。

(A) 碳青霉烯酶抑制增強實驗和凝膠電泳結(jié)果 (B)碳青霉烯酶基因測序結(jié)果

2.3腸道CRE攜帶患者的基礎臨床資料由表3可知,統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)CRE腸道攜帶組與無攜帶組住院者在年齡、性別、住院時間、慢性呼吸道疾病、慢性泌尿系統(tǒng)疾病、慢性心臟疾病、慢性胃腸道疾病、糖尿病、高血壓、腦血管意外、長期臥床、 ICU轉(zhuǎn)入、導尿管使用上的臨床特征均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),只有長期留置胃管(>30 d)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明長期使用留置胃管(>30 d)的患者最有可能是CRE腸道攜帶者,具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 腸道CRE攜帶患者基礎臨床資料

3 討論

CRE可以在住院患者的胃腸道中存活而不引起任何感染癥狀,據(jù)報道,糞便CRE攜帶是發(fā)生CRE感染的重要危險因素,有CRE定植的嚴重疾病患者其感染CRE風險至少比沒有CRE定植的患者高兩倍,同時從感染控制的角度來看,區(qū)分CRE的耐藥機制具有重要的感染控制意義[7]。本研究的目的是確定老年護理醫(yī)院長期在院患者CRE的腸道攜帶率,闡明腸道攜帶CRE的表型和分子特征,發(fā)現(xiàn)潛在的腸道攜帶CRE的患者臨床特征,為老年護理醫(yī)院早期防控CRE提供依據(jù)。

西班牙的Aranzábal等[4]對馬德里社區(qū)3家長期護理醫(yī)院開展腸道攜帶CRE主動篩查時發(fā)現(xiàn),腸道CRE平均攜帶率為4.1%,在菌群分布上以CR-KPN為主,其次才是CR-ECO。Yamamoto等[8]研究發(fā)現(xiàn)日本大阪北部長期護理醫(yī)院住院患者腸道CRE的攜帶率為14.9%,菌群分布以CR-ECO為主,其次是CR-KPN,而比利時的研究者在1家老年護理醫(yī)院未發(fā)現(xiàn)腸道攜帶CRE的患者[9]。在本研究中, CRE腸道攜帶者的所占比為8.18%,高于Aranzábal[4]等人的研究結(jié)果,但低于Yamamoto[8]等人研究結(jié)果, CRE的菌群分布與以上文章所報道的不盡相同,可見腸道攜帶CRE患者的檢出率以及CRE的菌屬分布的差異與患者所在區(qū)域的醫(yī)療環(huán)境有關。

隨著亟需長期恢復治療的老年患者向老年護理醫(yī)院轉(zhuǎn)移, CRE有從綜合性醫(yī)療機構(gòu)向老年照護機構(gòu)播散的風險。研究發(fā)現(xiàn)日本大阪長期護理醫(yī)院住院患者腸道攜帶CRE中95.7%的菌株是攜帶blaIMP的CPE,同時期當?shù)鼐C合性醫(yī)院最流行的碳青霉烯酶是IMP型[8,10]。Aranzábal等[4,11]發(fā)現(xiàn)OXA-48是西班牙馬德里長期護理醫(yī)院患者腸道攜帶CPE產(chǎn)生的主要碳青霉烯酶,同時期該地區(qū)流行的CPE主要攜帶blaOXA-48。本研究中腸道攜帶CR-KPN以產(chǎn)KPC(83.33%)為主, CR-ECO以產(chǎn)NDM(77.78%)為主,與全國范圍36家綜合性醫(yī)院流行CRE的產(chǎn)碳青霉烯酶分布情況相符[12]?？梢园l(fā)現(xiàn)不同地域老年護理醫(yī)院住院患者腸道攜帶CPE表達的碳青霉烯酶與同區(qū)域流行CPE的產(chǎn)碳青霉烯酶型別相似,可能是攜帶CRE的患者由綜合性醫(yī)院向老年護理醫(yī)院轉(zhuǎn)移導致這種相似。本次研究發(fā)現(xiàn)老年護理醫(yī)院腸道攜帶blaNDM的CPE檢出率較高,攜帶blaNDM-5的均是CR-ECO,考慮到blaNDM-5菌株的播散風險,臨床上應關注住院患者的腸道CRE的攜帶情況[13]。

外源性因素是醫(yī)院患者獲得CRE的主要原因,及時發(fā)現(xiàn)攜帶CRE高風險患者,可以指導臨床及時采取額外的干預措施限制CRE的播散,但不同類別機構(gòu)的住院患者腸道攜帶CRE的因素不盡相同。Yamamoto[8]等研究發(fā)現(xiàn)腸道攜帶CRE患者危險因素是長期住院時間、腸內(nèi)營養(yǎng)和抗菌藥物暴露史,其中腸內(nèi)營養(yǎng)是最高的危險因素。也有研究結(jié)果顯示高?？剖易≡夯颊咧心挲g≥60歲、留置胃管是腸道發(fā)現(xiàn)CRE陽性的危險因素[14]。本組研究發(fā)現(xiàn)侵入性操作的長期使用留置胃管(>30d)的患者最有可能是CRE的腸道攜帶者,與以上老年患者CRE腸道定植的高危因素結(jié)果相符,建議老年護理醫(yī)院應對長期使用留置胃管(>30d)的患者加強CRE的防控措施。防控CRE的措施有多種,對于老年護理醫(yī)院等類似的養(yǎng)老機構(gòu)還應當加強生活照護護理員的培訓與監(jiān)督[15]。

綜上所述,老年護理醫(yī)院長期住院者中有較高比例的CRE腸道攜帶者,腸道攜帶CRE的分子特征提示有播散的風險,長期使用留置胃管(>30 d)的住院者最有可能是CRE的腸道攜帶者,因此建議老年護理醫(yī)院應對剛?cè)朐阂约伴L期住院者開展定期的腸道CRE篩查,臨床上應采取適當?shù)母深A措施控制應對腸道CRE的攜帶定植。