岳明強 孫立華 郜慶祖 王昕紅

河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科 (河南 新鄉(xiāng), 453000)

肝細(xì)胞癌簡稱肝癌,肝癌死亡率位居全球癌癥死亡第4位,主要風(fēng)險因素包括慢性乙型病毒性肝炎、慢性丙型病毒性肝炎、黃曲霉毒素、飲酒、代謝異常等[1]。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示[2],2020年全球肝癌死亡例數(shù)約為80萬例,中國肝癌發(fā)病率約為18.2/(10萬),死亡率約為17.2/(10萬),且肝癌發(fā)病數(shù)隨年齡增加逐漸上升。發(fā)生局部侵襲、轉(zhuǎn)移的肝癌患者預(yù)后更差,死亡率更高[3],因此,早期明確肝癌的發(fā)病機制、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后標(biāo)志物顯得尤其重要。妊娠上調(diào)的非泛素性鈣調(diào)蛋白激酶(PNCK)是鈣調(diào)蛋白激酶Ⅰ家族成員之一,近年來發(fā)現(xiàn)PNCK屬于一種促癌基因,在多種腫瘤如鼻咽癌[4]、乳腺癌[5]等顯著高表達(dá),且與不良預(yù)后有關(guān)。然而,目前關(guān)于PNCK在肝癌中的表達(dá)及相關(guān)機制尚不清楚,本研究通過生物信息學(xué)方法探討PNCK在肝癌中的表達(dá)水平及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫 TCGA數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga);GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/);HPA數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/);TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/);DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp);LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(http://www.linkedomics.org)?

1.2 研究方法

1.2.1 PNCK mRNA在肝癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系TCGA數(shù)據(jù)庫中下載肝癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù),其中肝癌組織374例,正常組織50例,還包括50例癌組織及配對的癌旁組織,樣本中PNCK mRNA表達(dá)水平采用Log2轉(zhuǎn)換。肝癌患者預(yù)后的危險因素采用Cox回歸分析。

1.2.2 K-M曲線生存分析 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平和患者中位生存時間的關(guān)系。

1.2.3 肝癌組織中PNCK蛋白表達(dá)水平 利用HPA數(shù)據(jù)庫分析PNCK蛋白在肝癌組織及正常組織中的表達(dá)差異。

1.2.4 免疫浸潤分析 通過TIMER數(shù)據(jù)庫中的“Immune association”模塊探索PNCK與肝癌組織中免疫細(xì)胞浸潤程度的相關(guān)性,包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞(Neutrophils細(xì)胞)、樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)等。

1.2.5 肝癌組織中PNCK共表達(dá)基因 從LinkedOmics數(shù)據(jù)庫中篩選肝癌組織中與PNCK共表達(dá)基因,參數(shù)設(shè)置P-Spearman<0.01。分別獲取前50個與PNCK顯著正相關(guān)和顯著負(fù)相關(guān)的基因。

1.2.6 GO、KEGG富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫對100個共表達(dá)基因進行功能注釋和富集分析,主要包括基因本體論(GO)和KEGG信號通路。GO分析包括細(xì)胞組成(CC)、分子功能(MF)和生物學(xué)過程(BP)。本研究中選擇富集最為顯著的前5個條目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 肝癌組織中和正常組織及癌旁組織中PNCK mRNA表達(dá)差異的比較采用Wilcoxon檢驗,肝癌患者預(yù)后的危險因素采用Cox回歸分析,PNCK mRNA表達(dá)水平與肝癌患者中位生存時間的相關(guān)性采用K-M曲線分析,免疫浸潤分析采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNCK mRNA表達(dá)水平和肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析 單因素結(jié)果顯示,T分期、M分期、病理學(xué)分期、PNCK mRNA表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后有關(guān);多因素分析結(jié)果顯示,PNCK mRNA表達(dá)水平(高表達(dá))是影響肝癌患者預(yù)后的危險因素,見表1。K-M曲線結(jié)果證實,PNCK mRNA高表達(dá)及低表達(dá)的肝癌患者生存時間為46.6和84.4個月,與PNCK mRNA低表達(dá)相比,PNCK mRNA高表達(dá)患者中位生存時間顯著降低(P=0.002),見圖1。

圖1 PNCK mRNA表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的K-M曲線

表1 肝癌患者預(yù)后的危險因素COX回歸分析

2.2 PNCK mRNA在肝癌組織中的表達(dá)水平 肝癌組織374例,正常組織50例,肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平為0.041(0.010,0.365),正常組織中PNCK mRNA表達(dá)水平為0(0,0.015),與正常組織相比,肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.001);50例肝癌組織及配對的癌旁組織,肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平為0.028(0,0.194),正常組織中PNCK mRNA表達(dá)水平為0(0,0.015),與正常組織相比,肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)。見圖2。

圖2 不同組織中PNCK mRNA表達(dá)水平

2.3 肝癌組織中PNCK蛋白表達(dá)情況 HPA數(shù)據(jù)庫結(jié)果提示,PNCK蛋白在肝癌組織中呈高表達(dá),在正常肝臟組織中呈低表達(dá)。PNCK在肝癌中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中, 見圖3。

圖3 HPA數(shù)據(jù)庫中PNCK在正常組織及肝癌組織中的表達(dá)(×200 μm)

2.4 肝癌中PNCK與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性 進一步探討肝癌組織中PNCK和免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性,結(jié)果顯示,肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平與Th2細(xì)胞、TFH細(xì)胞、NK CD56bright細(xì)胞等呈顯著正相關(guān)(P<0.001),與DC細(xì)胞、Neutrophils、Th17 細(xì)胞等呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.001)。見圖4和表2。

圖4 肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

表2 肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

2.5 肝癌中PNCK共表達(dá)基因及GO、KEGG富集分析 通過數(shù)據(jù)庫進一步篩選前50個與PNCK顯著正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因,將100個共表達(dá)基因進行GO、KEGG富集分析,結(jié)果顯示,肝癌組織中PNCK共表達(dá)基因主要富集的BP包括胰島素分泌調(diào)節(jié)等;主要富集的CC包括線粒體基質(zhì)等;主要富集的MF包括氧化還原活動等;主要富集的KEGG信號通路包括代謝途徑、丙酮酸代謝、糖酵解和糖異生等。結(jié)果見表3。

表3 肝癌組織中PNCK共表達(dá)基因的GO、KEGG富集分析

3 討論

肝癌屬于全球最為常見的惡性腫瘤之一,多由于慢性乙型病毒性肝炎發(fā)展導(dǎo)致,發(fā)病率和死亡率均較高。鑒于肝癌發(fā)病機制復(fù)雜,篩選出新的肝癌預(yù)后標(biāo)志物對提高肝癌患者的預(yù)后和實現(xiàn)個體化靶向生物治療均有著重要意義。PNCK是鈣調(diào)蛋白激酶Ⅰ家族成員之一,具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,人PNCK基因定位于Xq28,既往認(rèn)為,PNCK表達(dá)可能限于特定的乳腺上皮細(xì)胞類型[6],而近年來發(fā)現(xiàn)PNCK在多種腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象[4-5,7],Xu等[7]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)PNCK在鼻咽癌中顯著高表達(dá),PNCK沉默后通過PI3K-AKT信號通路抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲并促進凋亡。然而,目前PNCK在肝癌中的具表達(dá)水平尚不清楚。本研究基于多個數(shù)據(jù)庫結(jié)果證實,PNCK在肝癌組織中顯著高表達(dá),且預(yù)后分析也證實PNCK高表達(dá)是影響肝癌患者不良預(yù)后的獨立危險因素,PNCK高表達(dá)的肝癌患者中位生存時間顯著縮短,這結(jié)果均提示PNCK可能在一定程度上促進了肝癌的發(fā)生發(fā)展,PNCK可作為肝癌預(yù)后不良的標(biāo)志物之一,PNCK可作為肝癌個體化靶向治療的一個新靶點。

腫瘤常常伴隨著免疫微環(huán)境異常,腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境,近年來發(fā)現(xiàn)免疫微環(huán)境在在肝癌進展、免疫耐受、免疫逃逸和治療抵抗中發(fā)揮著重要作用[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中PNCK mRNA表達(dá)水平與多種免疫細(xì)胞浸潤程度顯著相關(guān),如PNCK mRNA與Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤程度具有顯著正相關(guān)性,Th2細(xì)胞作為一種T淋巴細(xì)胞亞型,研究顯示Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-4和IL-6在肝癌患者血清中顯著高表達(dá)[11],且相對于無肝癌家族成員而言,Th2細(xì)胞相關(guān)因子IL-4表達(dá)水平在肝癌家族患者中表達(dá)水平更高[12],在肝癌經(jīng)過熱消融治療后,癌組織和血清中Th2相關(guān)性細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著下降[13]。巨噬細(xì)胞主要起源于骨髓源性單核細(xì)胞,M2型巨噬細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子刺激腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[14]。孫文兵等[15]證實肝癌細(xì)胞來源外泌體miR-151可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型轉(zhuǎn)化從而促進肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲,此外,抗腫瘤藥物高良姜素可通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路促進巨噬細(xì)胞M2型向M1型轉(zhuǎn)化,降低Zbed3表達(dá)水平并促進肝癌細(xì)胞凋亡并減小瘤體體積[16]。

為進一步探討PNCK在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機制,我們基于LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫共鑒定出肝癌中與PNCK顯著相關(guān)的100個共表達(dá)基因,對共表達(dá)基因進行GO和KEGG富集分析,結(jié)果顯示,這些共表達(dá)基因主要富集于丙酮酸代謝、糖酵解等途徑,提示PNCK主要涉及代謝編程途徑等參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤細(xì)胞中,有氧糖酵解是腫瘤細(xì)胞獲取能量的主要途徑,腫瘤免疫微環(huán)境中成熟T細(xì)胞會發(fā)生代謝重編程,可活化有氧糖酵解途徑,為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量[17]。郭舜等[18]研究發(fā)現(xiàn),黃芩素可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲,同時顯著降低肝癌細(xì)胞的能量代謝水平,作用機制與其能抑制肝癌細(xì)胞糖酵解及谷氨酰胺代謝有關(guān),此外,白藜蘆醇同樣可通過調(diào)節(jié)糖代謝重編程抑制肝癌細(xì)胞的增殖[19]。因此,上述結(jié)果提示PNCK可能通過調(diào)節(jié)代謝編程促進肝癌的進展。

綜上所述,PNCK在肝癌中高表達(dá),可能作為肝癌預(yù)后不良的標(biāo)志物之一,PNCK可能通過調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境及代謝編程等途徑參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展,本研究為肝癌的個體化診療提供了新的靶點,然而,PNCK在肝癌中的功能和作用還需要分子生物學(xué)實驗進一步驗證。