賀 娟 熊明月 謝喜科 易廷莊

1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生院 (廣西 百色, 533000) 2.百色人民醫(yī)院血液科 3.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科

肝癌是比較常見的惡性腫瘤,其死亡率、發(fā)病率居高不下,外科手術(shù)切除是肝癌治療的主要途徑,但是術(shù)后癌細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移依然較高,這也是導(dǎo)致肝癌預(yù)后不良的原因[1]。肝癌細(xì)胞異常增殖分化、轉(zhuǎn)移及凋亡阻礙是肝癌發(fā)生的原因,免疫逃避也是影響其惡性進展的原因,這些免疫系統(tǒng)可以識別癌細(xì)胞,通過調(diào)動免疫反應(yīng)進而殺死腫瘤細(xì)胞,以達(dá)到抗腫瘤的目的[2,3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)一種具有多功能特征的非編碼RNA,在不同組織及細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá),不僅與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等過程有關(guān),還與腫瘤免疫逃避有關(guān)[4]。研究報道顯示,SNHG4可參與腫瘤惡性進展,在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào),SNHG4可通過調(diào)控miR-144-3p表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和免疫逃避,及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。有報道發(fā)現(xiàn),SNHG4在肝癌組織內(nèi)高表達(dá),與組織學(xué)分級、腫瘤分期、生存率相關(guān),可作為肝癌預(yù)后獨立因子[6],但其對肝癌細(xì)胞的具體作用機制不清楚。在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示,miR-152-3p是SNHG4靶基因,有報道顯示,miR-152-3p可作為肝癌抑癌基因,miR-152-3p可通過靶向負(fù)調(diào)控ROBO1抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進凋亡,且與免疫相關(guān)分子呈正相關(guān)[7]。關(guān)于SNHG4能否調(diào)控miR-152-3p對肝癌細(xì)胞的研究未經(jīng)報道,鑒于此,本研究主要探究lncRNA SNHG4可能通過調(diào)控miR-152-3p對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及免疫因子的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人肝癌細(xì)胞(HepG2、SNU-398、Hep3B)、人永生化正常肝細(xì)胞(THLE-2)購于美國ATCC公司;Lipofectamine 3000試劑盒、TRlzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo Fisher公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;si-NC、si-SNHG4、miR-NC、miR-152-3p、anti-miR-NC、anti-miR-152-3p、pcDNA、pcDNA-SNHG4、引物購于上海吉瑪公司;2×SYBR Green qPCR試劑盒購于大連寶豐生物公司;CCK8試劑盒、凋亡試劑盒購于上海碧云天公司;RIPA裂解液、雙熒光素酶報告基因試劑盒、BCA試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑購于北京索萊寶公司;PCNA抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、GAPDH、HRP偶聯(lián)二抗IgG購于美國Abcam公司;TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒購于北京達(dá)科為生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組 人肝癌細(xì)胞(HepG2、SNU-398、Hep3B)、THLE-2均培養(yǎng)在含有胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi),置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞,接種于96孔板中,細(xì)胞融合為85%時,參照Lipofectamine 3000試劑盒說明書將si-NC、si-SNHG4、miR-NC、miR-152-3p、si-SNHG4與anti-miR-NC、si-SNHG4與anti-miR-152-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi),6 h更換細(xì)胞培養(yǎng)液,分別記為si-NC組、si-SNHG4組、miR-NC組、miR-152-3p組、si-SNHG4+anti-miR-NC組、si-SNHG4+anti-miR-152-3p組。

1.3 qRT-PCR法檢測SNHG4、miR-152-3p表達(dá)水平 TRlzol法分離肝癌細(xì)胞(HepG2、SNU-398、Hep3B)、THLE-2以及各組HepG2細(xì)胞(培養(yǎng)24 h)內(nèi)總RNA,然后合成cDNA模板,用2×SYBR Green qPCR試劑盒在ABI7000儀器上進行擴增反應(yīng)。2-ΔΔCt方法計算SNHG4、miR-152-3p表達(dá)水平,以GAPDH和U6作為內(nèi)參。SNHG4正向引物:5′-AGGTCGGCCGCAT-GCTACGG-3′,反向引物:5′-TCAAACGATCCGCGCTACGAG-CG-3′;GAPDH正向引物:5′-CTCAGCATCGACGATCAC-GC-3′,反向引物:5′-CTAGCTGCATCGATCAGCGTC-3′。miR-152-3p正向引物:5′-GCAGTCAGTGCATGACAGA-3′,反向引物:5′-GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCCAAG-3′;U6 正向引物:5′-CTCG-CTTCGGCAGCACA-3′,反向引物:5′-ACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′。

1.4 CCK8法檢測細(xì)胞活性 將各組HepG2細(xì)胞以1×103個接種于96孔板中,培養(yǎng)48 h后加CCK8試劑(10 μl/孔),繼續(xù)培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值(A)。細(xì)胞活性(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用PBS清洗,加胰酶消化后,使用結(jié)合緩沖液100 μl 制成單細(xì)胞懸液,并加入5 μl的Annexin V-FITC和PI試劑,避光反應(yīng)20 min,最后加400 μl 結(jié)合緩沖液,上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液從各組HepG2細(xì)胞內(nèi)提取細(xì)胞總蛋白,并進行定量分析,按照BCA法進行,用10% SDS-PAGE凝膠分離樣品(30 μg),分離結(jié)束轉(zhuǎn)移PVDF膜上,37℃封閉在脫脂奶粉中1.5 h,與一抗PCNA(1∶800稀釋)、Bcl-2(1∶800稀釋)、Bax(1∶500稀釋)、GAPDH(1∶1 000稀釋)4℃下過夜,次日37℃下與HRP偶聯(lián)二抗IgG(1∶5 000稀釋)孵育1.5 h,加化學(xué)發(fā)光試劑使其顯色,曝光。用ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

1.7 ELISA法檢測TNF-α、IL-6表達(dá)水平 各組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h,離心后按照TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒操作步驟,檢測上清液中TNF-α、IL-6表達(dá)水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗驗證SNHG4和miR-152-3p靶向關(guān)系 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示miR-152-3p與SNHG4存在互補的結(jié)合位點,并構(gòu)建SNHG4野生型、突變型質(zhì)粒,將其克隆至pGL3載體上,即為SNHG4 WT、SNHG4 MUT,然后分別與miR-NC、miR-152-3p共轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞內(nèi),在24孔板中進行孵育,48 h收集細(xì)胞,使用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-SNHG4轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞內(nèi),培養(yǎng)48 h,按照qRT-PCR方法檢測SNHG4、miR-152-3p表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞SNHG4和miR-152-3p中的表達(dá) 與THLE-2細(xì)胞比較,肝癌細(xì)胞HepG2、SNU-398和Hep3B內(nèi)SNHG4表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),miR-152-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),其中HepG2細(xì)胞SNHG4和miR-152-3p表達(dá)水平差異較大,故選擇HepG2細(xì)胞進行實驗。見表1。

表1 SNHG4和miR-152-3p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 SNHG4調(diào)控miR-152-3p的表達(dá) SNHG4和miR-152-3p互補核苷酸序列見圖1。與miR-NC組比較,miR-152-3p組內(nèi)SNHG4 WT熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。見表2。與pcDNA組比較,pcDNA-SNHG4組內(nèi)SNHG4表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),miR-152-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

圖1 SNHG4和miR-152-3p互補核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 轉(zhuǎn)染SNHG4在HepG2細(xì)胞中SNHG4、miR-152-3p表達(dá)

2.3 干擾SNHG4對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和免疫因子表達(dá)的影響 與si-NC組比較,si-SNHG4組內(nèi)SNHG4表達(dá)水平、細(xì)胞活性、TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05),而PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖2,表4。

表4 沉默SNHG4對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和免疫因子表達(dá)的影響

2.4 過表達(dá)miR-152-3p對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和免疫因子表達(dá)的影響 與miR-NC組比較,miR-152-3p組內(nèi)miR-152-3p表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05),細(xì)胞活性、TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著降低,而PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 過表達(dá)miR-152-3p對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響 (A.凋亡圖;B.PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá))

表5 過表達(dá)miR-152-3p對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和免疫因子表達(dá)的影響

2.5 抑制miR-152-3p可逆轉(zhuǎn)干擾SNHG4對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和免疫因子表達(dá)的影響 與si-SNHG4+anti-miR-NC組比較,si-SNHG4+anti-miR-152-3p組內(nèi)miR-152-3p表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),細(xì)胞活性、TNF-α、IL-6表達(dá)水平顯著增加,而PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖4,表6。

圖4 抑制miR-152-3p可逆轉(zhuǎn)干擾SNHG4對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響 (A.凋亡圖;B.PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá))

表6 抑制miR-152-3p可逆轉(zhuǎn)干擾SNHG4對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和免疫因子表達(dá)的影響

3 討論

lncRNA在真核細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá),已被確定是多種細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子,從而發(fā)揮在腫瘤內(nèi)的作用,其有望成為腫瘤診斷和治療的生物作用靶點[8,9]。近年的研究結(jié)果顯示,lncRNA可通過發(fā)揮分子海綿作用吸附下游miRNA進而調(diào)控mRNA表達(dá),從而參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)過程及免疫逃避[10]。研究結(jié)果顯示,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中SOX2-OT高表達(dá),SOX2-OT通過靶向調(diào)控miR-30d-5p/PDK1軸促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及免疫逃避,抑制細(xì)胞凋亡[11]。肺癌細(xì)胞中LINC01140表達(dá)下調(diào),LINC01140可通過直接調(diào)控miR-33a-5p和miR-33b-5p促進肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)過程,及免疫逃避[12]。有報道顯示,Hotair在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中高表達(dá),敲低Hotair可通過調(diào)控miRNA-30a/GRP78/PD-L1軸促進喉鱗狀細(xì)胞癌凋亡,并抑制細(xì)胞增殖和免疫逃避[13]。SNHG4是lncRNASNHG家族成員,在胃癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤等癌癥中高表達(dá),可參與多種腫瘤進展[14,15]。有報道發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞內(nèi)SNHG4表達(dá)上調(diào),SNHG4可通過調(diào)節(jié)miR-590-3p/CDK1軸促進結(jié)直腸癌組織和周期發(fā)展[16]。還有研究通過篩選肝癌細(xì)胞焦亡相關(guān)LncRNA發(fā)現(xiàn),SNHG4表達(dá)增加[17],但是具體作用不清楚。本研究結(jié)果顯示,SNHG4在HepG2細(xì)胞中高表達(dá),干擾SNHG4能降低HepG2細(xì)胞活性、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá),并增加凋亡率及Bax蛋白表達(dá),提示干擾SNHG4可抑制HepG2細(xì)胞增殖和促進凋亡,其有望成為肝癌生物標(biāo)志物。腫瘤免疫逃避也是腫瘤發(fā)生的主要因素之一,TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子,可作為免疫抑制因子參與腫瘤細(xì)胞免疫逃避[18]。本研究顯示,干擾SNHG4可降低HepG2細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)水平,表明SNHG4可抑制HepG2細(xì)胞免疫因子表達(dá)。

本研究結(jié)果證實了SNHG4能靶向負(fù)調(diào)控miR-152-3p的表達(dá)。miR-152-3p在多種癌癥中表達(dá)下調(diào),并可通過調(diào)控下游mRNA或信號通路促進腫瘤細(xì)胞惡性進展[19-21]。研究結(jié)果顯示,在肝癌組織中miR-152-3p表達(dá)下調(diào),并與CDK8呈負(fù)相關(guān),可通過靶向調(diào)控CDK8抑制肝癌細(xì)胞增殖和促進凋亡[22]。還有報道顯示,在肝癌復(fù)發(fā)患者組織內(nèi)miR-152-3p表達(dá)下調(diào),并通過靶向AKAP1、FOXRED1等影響肝癌發(fā)展,提示miR-152-3p有望成肝癌作用靶點[23]。本研究顯示,在HepG2細(xì)胞中miR-152-3p低表達(dá),過表達(dá)miR-152-3p降低HepG2細(xì)胞活性、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá),及TNF-α、IL-6表達(dá)水平,并增加凋亡率及Bax蛋白表達(dá),提示過表達(dá)miR-152-3p抑制HepG2細(xì)胞增殖和免疫因子表達(dá),并促進細(xì)胞凋亡。進一步實驗顯示,抑制miR-152-3p可減弱干擾SNHG4對HepG2細(xì)胞增殖、凋亡和免疫因子表達(dá)的影響,表明SNHG4能靶向負(fù)調(diào)控miR-152-3p發(fā)揮在肝癌中的作用。

綜上所述,SNHG4在HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào),干擾SNHG4抑制HepG2細(xì)胞增殖和免疫因子表達(dá),促進細(xì)胞凋亡,其作用機制可能與調(diào)控miR-152-3p有關(guān)。