閃海霞 吳玉卓 顏成果 夏盼盼 李延玲 高 星 范崇桂

1.南陽市中心醫(yī)院感染性疾病科 (河南 南陽, 473000) 2.南陽市中心醫(yī)院超聲科 3.南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

乙型肝炎病毒(HBV)是引起乙型肝炎(CHB)最主要病原體類型。我國是CHB高發(fā)地區(qū),全球約1/3的HBV攜帶者在中國[1]。CHB的高發(fā)病率和致死率,使得該病成為威脅我國居民生命健康和生活質(zhì)量的重要疾病[2]。HBV是一種嗜肝性病毒,盡管CHB患者接受了抗病毒治療,但仍有部分可出現(xiàn)肝纖維化進展[3]。干擾素-α(IFN-α)不僅具有廣譜抗病毒作用,還有免疫調(diào)節(jié)作用[4]。近來研究發(fā)現(xiàn),IFN-α可能具有抗肝纖維化,改善肝功能的作用[5]。程序性死亡受體1(PD-1)/程序性死亡-配體1(PD-L1)通路是HBV感染及其相關肝病進展關鍵機制之一[6],亦是目前CHB免疫治療的重要靶點途徑。本研究制備了HBV感染小鼠模型,并以pKCMvint.IFN-α上調(diào)體內(nèi)IFN-α水平,以探討IFN-α對HBV感染引起的肝組織損傷和肝纖維化的作用及機制?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c小鼠45只,雌性,SPF級,周齡6～8周,平均(6.56±0.23)周,體質(zhì)量18～20 g,平均(19.13±0.56)g,購自山東博安生物技術股份有限公司[SCXK(魯)2020 0006]。自由飲食,單籠喂養(yǎng),溫度25～27℃,濕度40%～45%。

1.2 主要試劑與儀器 pAAV/HBV1.2質(zhì)粒:BioVector NTCC中國質(zhì)粒載體菌種細胞基因保藏中心。pKCMvint.IFN-α及pKCMvint質(zhì)粒:德國埃森醫(yī)院病毒研究所。無菌PBS溶液、HE試劑盒:武漢博士德生物。小鼠HBeAg試劑盒、小鼠HBsAg試劑盒、qPCR試劑盒、通用RT-PCR試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒:上海恒斐生物。小鼠ALT試劑盒、小鼠AST試劑盒、總蛋白提取試劑盒:江西艾博因生物。血清總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Masson染色試劑盒:北京百奧萊博。PD-1抗體、PD-L1抗體:美國Abcam。Multiskan Sky全波長酶標儀、NANODROP 2000微量紫外分光光度計:美國賽默飛世爾。7900型PCR儀:美國ABI。

1.3 分組、模型構建及干預 參考文獻[7,8]將BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組、IFN-α組,每組各15只。模型組和IFN-α組小鼠經(jīng)尾靜脈高壓快速注射pAAV/HBV1.2 10 μg,注射總量為小鼠體質(zhì)量的8%～10%,對照組小鼠經(jīng)尾靜脈注射等劑量PBS溶液,后IFN-α組小鼠經(jīng)尾靜脈高壓注射pKCMvint.IFN-α 10 μg,注射總量為小鼠體質(zhì)量的8%～10%,模型組則注射等劑量pKCMvint。4周后進行指標觀察。

1.4 取材

1.4.1 血清樣本 于模型構建4周后,經(jīng)小鼠眼眶取血,6 000 r/min離心10 min,取血清,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 肝臟組織 頸椎脫臼法處死小鼠,消毒腹部,打開腹腔,暴露肝臟,取出肝臟組織;0.9%氯化鈉溶液沖洗,濾紙擦除殘留水分,4%多聚甲醛固定,-80℃保持備用。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 一般情況 記錄各組小鼠進食量、飲水量、毛發(fā)色澤及行為表現(xiàn)。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) ELISA法測定HBV血清病毒學指標、肝功能指標及IFN-α水平,其中HBV血清學指標包括乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg),肝功能指標包括:天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)。取血清樣本,PBS溶液以1∶20比例稀釋,按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR) qPCR技術測定血清HBV DNA復制水平。提取血清樣本總RNA,全波長酶標儀測定RNA濃度;以RNA為模板,按照試劑盒說明書操作,將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以β-actin為內(nèi)參,上游引物5＇-GCC-CTGAGGCTCTCTTCCA-3＇,下游引物5＇-GCGGATGTCGACGTCA-CA-3＇,HBV上游引物5＇-TGGTGTCTTTGGAGTGTGGAT-3＇,下游引物5＇-TAACATTGAGATTCCCGAGATTG-3＇;PCR反應體系:cDNA 2.0 μl、上游和下游引物各1.0 μl、qPCR mix 10.0 μl、ddH2O 6.0 μl;反應條件:95℃ 2 min,94℃ 20 s,60℃ 20 s,72℃ 30 s,40個循環(huán);PCR儀測定HBV DNA值,實驗重復3次,取平均值。

1.5.4 蘇木精-伊紅(HE)染色法 HE染色法觀察肝組織形態(tài)學改變。取由4%多聚甲醛固定的肝臟組織,經(jīng)不同濃度乙醇脫水、二甲苯透明后,石蠟包埋,制備厚0.4 μm切片;后經(jīng)二甲苯脫蠟,不同濃度乙醇水化,純凈水沖洗3～5 min;蘇木素染色5 min,水洗1～3 min;0.5%鹽酸酒精分化3～10 s,磷酸氫二鈉溶液反藍10 min;70%乙醇和80%乙醇各5 min,伊紅染色30 s,蒸餾水沖洗;脫水、透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學。

1.5.5 Masson染色法 Masson染色觀察肝組織纖維化程度。取組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水化后,蘇木精染核5～10 min;蒸餾水沖洗,Masson染液染色5～10 min;2%冰醋酸浸洗,1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min,苯胺藍染色5 min;2%冰醋酸浸洗,脫水、透明,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察染色情況,膠原纖維呈藍色,胞質(zhì)、纖維素、神經(jīng)膠質(zhì)呈紅色,胞核呈黑藍色。

1.5.6 免疫組化染色法 免疫組化染色法測定肝組織PD-1和PD-L1表達。取組織石蠟切片,經(jīng)脫蠟、水化后,滴加PD-1抗體(1∶50)和PD-L1抗體(1∶25),4℃過夜孵育;滴加二抗,室溫孵育2 h;DAB液顯色,鏡下觀察染色情況,自來水終止反應;蘇木精復染,脫水、透明,中性樹膠封片;隨機選取5個高倍視野,觀察染色強度和陽性細胞數(shù)量,根據(jù)免疫反應積分評分法[9],兩者積分乘積大于3視為陽性。

1.5.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot) WB法測定肝組織PD-1和PD-L1蛋白表達水平。提取肝組織總蛋白,BCA法進行蛋白定量;EP管內(nèi)加入20 μl 5×蛋白上樣緩沖液,沸水煮沸;瓊脂糖凝膠電泳,收集蛋白樣本,濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜;4℃下脫脂奶粉封閉4 h,滴加PD-1抗體、PD-L1抗體,4℃過夜;TBST洗膜3次,每次20 min;滴加二抗,4℃孵育2 h;TBST洗膜3次,每次20 min;ECL顯影,ImageJ軟件分析。

1.5.8 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR) RT-PCR技術測定肝組織PD-1和PD-L1 mRNA相對表達量。Trizol法提取肝組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;以GAPDH為內(nèi)參,上游引物5＇-GGTAGAACGTCCGTGTTTCA-3＇,下游引物5＇-TTCAGTCCCA-GTCATGGAAC-3＇,PD-1上游引物5＇-ATCTCACCGCTCGTTT-CCT-3＇,下游引物5＇-CACTGCAAACCTCGGTGATG-3＇,PD-L1上游引物5＇-GGTAATCCGTTTCCCTTGA-3＇,下游引物5＇-CCTAA-TTTATGAGCCTATC-3＇;PCR反應體系:cDNA 1.0 μl、上游和下游引物各0.4 μl、PCR mix 10.0 μlL、ddH2O 8.2 μl;反應條件:98℃ 30 s預變性,98℃ 10 s,50℃ 30 s,72℃ 45 s,35個循環(huán);結果采用2-△△Ct法分析,實驗重復3次,取平均值。

2 結果

2.1 3組小鼠一般情況 與對照組比較,模型組小鼠進食量和飲水量減少,毛發(fā)色澤變暗,活動減少,部分出現(xiàn)精神萎靡或腹水;與模型組比較,IFN-α組小鼠進食量和飲水量逐漸恢復正常,毛發(fā)色澤較前改善,精神狀態(tài)亦變好,無明顯腹水。

2.2 3組小鼠肝組織病理學形態(tài)及纖維化情況 對照組小鼠肝細胞形態(tài)完整,肝小葉結構完整,肝組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)纖維化染色。與對照組比較,模型組小鼠肝細胞排列異常,出現(xiàn)假肝小葉,細胞內(nèi)大量炎癥浸潤,且肝組織內(nèi)有大量藍色或灰藍色膠原纖維染色;與模型組比較,IFN-α組小鼠肝細胞損傷明顯減輕,僅有少量炎癥浸潤,肝組織內(nèi)纖維化染色減少。圖1、2。

圖1 各組小鼠肝組織病理學形態(tài)比較 (HE染色×400)

圖2 各組小鼠肝組織病理肝纖維情況比較 (HE染色×400)

2.3 3組小鼠HBV血清學病毒指標及HBV DNA復制水平IFN-α組小鼠血清HBeAg、HBsAg及HBV DNA水平均顯著低于模型組(P<0.05)。

表1 各組小鼠HBV血清學指標及HBV DNA復制水平

2.4 3組小鼠肝功能指標及IFN-α表達水平 模型組小鼠血清AST和ALT水平顯著高于對照組(P<0.05);IFN-α組小鼠血清IFN-α水平顯著高于模型組,AST和ALT水平顯著低于模型組(P<0.05)。表2。

表2 各組小鼠AST、ALT和IFN-α表達情況比較

2.5 3組小鼠肝組織PD-1和PD-L1表達 免疫組化染色顯示,對照組小鼠肝組織內(nèi)PD-1和PD-L1表達均呈陰性,模型組小鼠肝組織內(nèi)可見大量陽性染色細胞,IFN-α組小鼠肝組織內(nèi)PD-1和PD-L1陽性染色細胞明顯減少,圖3。Western Blot和RT-PCR顯示,模型組小鼠肝組織內(nèi)PD-1和PD-L1蛋白及mRNA水平顯著高于對照組,IFN-α組上述指標水平則顯著低于模型組(P<0.05)。見圖4。

圖3 各組小鼠肝組織PD-1和PD-L1表達情況比較(免疫組化×200)

圖4 各組小鼠肝組織內(nèi)PD-1和PD-L1 mRNA及蛋白表達水平

3 討論

HBV感染是各種肝病的重要發(fā)病原因,我國現(xiàn)存HBV感染者約有7 000萬例,占全球1/3發(fā)病人數(shù)[10]?？共《局委熓乔宄鼿BV,促進疾病轉(zhuǎn)歸的主要手段。但臨床實踐發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)抗病毒治療后,仍有相當一部分HBV感染患者有明顯肝臟炎癥和肝纖維化改變,療效欠佳[11,12]。研究表明,HBV持續(xù)感染是肝硬化、肝細胞癌等終末期肝病的危險因素[13]。如何降低HBV復制水平,逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程,促進肝功能恢復是臨床醫(yī)生關注焦點。

本研究經(jīng)小鼠尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2制備HBV感染小鼠模型,HE染色和Masson染色分別觀察肝組織形態(tài)學及纖維化改變發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組小鼠肝細胞排列異常,出現(xiàn)假肝小葉,細胞內(nèi)大量炎癥浸潤,且肝組織內(nèi)有大量藍色或灰藍色膠原纖維染色,且在肝功能指標上,模型組小鼠血清AST和ALT水平顯著高于對照組,提示HBV感染可引起肝臟病理學及纖維化改變,進而影響肝功能。另外,測定血清HBV血清學和肝功能指標發(fā)現(xiàn),對照組小鼠血清HBeAg、HBsAg及HBV DNA陰性,模型組小鼠血清中可檢測出HBeAg、HBsAg及HBV DNA,以上結果提示HBV感染小鼠模型構建成功[14]。

干擾素一類具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多功能糖蛋白。既往研究多聚焦于IFN-γ在HBV感染中的作用,發(fā)現(xiàn)IFN-γ可通過增強HBV DNA復制水平參與慢性乙型肝炎發(fā)病過程[15]。與IFN-γ不同的是,IFN-α是聚集在9號染色體的Ⅰ型干擾素,幾乎所有有核細胞均能在感染時分泌IFN-α。IFN-α2為IFN-α亞型之一。已有研究發(fā)現(xiàn),IFN-α2可促進血清HBeAg和HBsAg轉(zhuǎn)陰,具有一定抗病毒效果[16]。且有報道稱,IFN-α可有效阻滯促炎因子生成,低肝纖維化小鼠體內(nèi)炎癥反應水平,同時通過調(diào)控相關通路信號傳導,抑制肝纖維化形成[17]。本研究經(jīng)HBV感染小鼠尾靜脈高壓注射pKCMvint.IFN-α發(fā)現(xiàn),小鼠血清IFN-α水平顯著升高,且與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義,提示IFN-α上調(diào)模型構建成功[18]。通過與模型組比較發(fā)現(xiàn),上調(diào)IFN-α表達后,HBV感染小鼠肝細胞損傷明顯減輕,炎癥浸潤和肝纖維化改變減少,AST和ALT水平顯著降低,提示IFN-α可減輕HBV引起的肝組織損傷和肝纖維化。同時在分析IFN-α對HBV復制和抗原表達影響發(fā)現(xiàn),IFN-α組小鼠血清HBeAg、HBsAg及HBV DNA水平均顯著低于模型組,進一步證實了IFN-α抗HBV作用,符合以往研究結果[19]。研究表明,PD-1及其配體PD-L1的上調(diào)在如CHB等病毒感染過程中有著重要作用[20]。有報道稱,阻斷PD-1/PD-L1途徑可達到較高的HBV病毒應答率,并有抗肝纖維化作用[21]。本研究結果顯示,模型組小鼠肝組織內(nèi)PD-1和PD-L1蛋白及mRNA水平顯著高于對照組,表明PD-1/PD-L1途徑的激活參與HBV感染,符合以往研究結果[20],通過上調(diào)IFN-α水平發(fā)現(xiàn),小鼠肝組織內(nèi)PD-1和PD-L1蛋白及mRNA水平顯著降低,提示IFN-α減輕HBV引起的肝組織損傷和肝纖維化的機制可能與阻斷PD-1/PD-L1途徑有關,這一結果為HBV感染治療提供了更多選擇。

綜上所述,IFN-α可減輕HBV引起的肝組織損傷和肝纖維化,其機制可能通過PD-1/PD-L1途徑阻止HBV DNA鏈延伸,進而終止病毒復制。