譚張奎 陳利鋒 盧綺萍

1.中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 (湖北 武漢, 430070) 2.中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普外科

膽汁淤積是由于膽管梗阻或膽汁的分泌-排泄過(guò)程受阻而引起的膽汁流動(dòng)受損,膽汁不循常道流入血液的病理狀態(tài),臨床可表現(xiàn)為全身或面色及小便發(fā)黃、乏力、瘙癢等[1]。膽汁淤積性肝損傷(CLI)由肝內(nèi)膽汁酸代謝異常以及膽汁酸蓄積,導(dǎo)致的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞受損或死亡。臨床中膽汁淤積患者可進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化,嚴(yán)重者可發(fā)生肝衰竭[2]。CLI與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)[3]。目前對(duì)膽汁淤積引發(fā)損害的病因及機(jī)制知之甚少,極大地限制了新藥治療物的發(fā)現(xiàn)。目前治療膽汁淤積的藥物以熊去氧膽酸(UDCA)和S-腺苷蛋氨酸(SAMe)為主,而這兩種藥物副作用明顯,部分患者對(duì)藥物不敏感[4],臨床治療效果受限,因此尋求新的治療藥物迫在眉睫。祖國(guó)醫(yī)學(xué)古籍中無(wú)膽汁淤積的病名,根據(jù)其癥狀表現(xiàn)可歸屬于“黃疸”范疇,消黃去疸湯來(lái)源于《石室秘錄》,主治“黃疸,一身盡黃,面目亦黃者”。現(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)其治療急性黃疸療效顯著[5],但缺乏進(jìn)一步研究。本文旨在探索經(jīng)典方劑消黃去疸湯的功效,進(jìn)一步明確其應(yīng)用范圍,為臨床提供依據(jù),豐富中醫(yī)藥治療肝膽疾病的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 28只8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠,體重150～200 g,由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供[許可證號(hào):SCXK(遼)2022-0001]。飼養(yǎng)于溫度20～25℃、濕度50%～70%環(huán)境,動(dòng)物自由攝食飲水。本研究經(jīng)過(guò)武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HLK-20230415-001)。

1.2 藥物及制備 消黃去疸湯由茵陳,薏苡仁、茯苓、車前子、肉桂組成,劑量比例為1∶3∶9∶0.2。以上藥材采購(gòu)于湖北省中醫(yī)院中藥房,藥材混合后用6倍量純凈水浸泡1.5 h,先武火再文火煎煮1 h,去滓存液;重復(fù)煎煮1次,合并2次濾液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至終濃度0.66 g/ml(以生藥量計(jì)),4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 α-萘異硫氰酸酯(ANIT)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。熊去氧膽酸(UDCA,國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20181059)購(gòu)自湖北省中醫(yī)院西藥房。堿性磷酸酶(ALP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、還原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司?？偰懠t素(TBil)、直接膽紅素(DBil)、總膽汁酸(TBA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Trizol、dNTP、Taq DNA聚合酶試劑購(gòu)自賽默飛公司。蘇木精購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;伊紅Y購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

FlexStation 3型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。JA5003型電子分析天平購(gòu)自上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司。Chemray型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自日本ASONE公司。Nano-100微量分光光度計(jì)購(gòu)自杭州奧盛儀器有限公司。HW-SY11-K電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司。EDC-810型PCR儀購(gòu)自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.3 分組、造模及給藥 28只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(NOM)、模型組(MOD)、熊去氧膽酸組(UDCA)、消黃去疸湯組(XHQD),每組7只。NOM組與MOD組大鼠給予同體積的生理鹽水灌胃,UDCA 組大鼠給予60 mg/kg UDCA灌胃,XHQD 組大鼠給予11.23 g/kg消黃去疸湯灌胃,連續(xù)7 d。于給藥第5天時(shí)除NOM組外其余各組大鼠給予75 mg/kg ANIT橄欖油溶液灌胃復(fù)制CLI模型[6],NOM組大鼠給予相同體積的橄欖油灌胃。

1.4 監(jiān)測(cè)各組膽汁淤積大鼠膽汁體積流量 各組大鼠腹腔注射麻醉,取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái),劍突下開(kāi)腹,進(jìn)行膽總管插管手術(shù)留取膽汁。為了確保準(zhǔn)確測(cè)量,插管5 min后對(duì)膽汁收集取樣90 min,每15 min記錄1次。膽汁體積流量=膽汁收集量/流出時(shí)間。

1.5 標(biāo)本采集 標(biāo)本采集前大鼠禁食不禁水12 h。第7天給藥2 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,打開(kāi)腹腔,使用負(fù)壓管從腹主動(dòng)脈采血。取出肝臟,稱重后自肝右葉剪取一部分肝組織放入4%多聚甲醛中固定以備HE染色檢查,一部分放入2.5%戊二醛溶液中固定以備電鏡檢查,剩余部分剪成若干小塊分裝于冷凍管后存于-80℃冰箱。采集的血液樣靜置1 h,3 000 rpm離心30 min,吸取上清液于離心管中,-80℃低溫冰箱保存待檢。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 采用全自助生化儀測(cè)定各組大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT活性及DBil、TBil、TBA水平。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠肝組織中SOD、GSH、MDA值。HE染色與透射電鏡觀察肝組織病理學(xué)變化。實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá),引物由華研生物科技有限公司合成,序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 消黃去疸湯對(duì)膽汁淤積大鼠膽汁流量的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠各個(gè)時(shí)間段膽汁流量均降低,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與MOD組比較,UDCA組大鼠15、30、75、90 min時(shí)間段膽汁流量升高,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),45、60 min膽汁流量隨升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);XHQD組大鼠各個(gè)時(shí)間段膽汁流量均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠膽汁流量

2.2 消黃去疸湯對(duì)膽汁淤積大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT活性及肝臟指數(shù)的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量增加,肝臟指數(shù)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與MOD組比較,UDCA組與XHQD組大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量減少,肝臟指數(shù)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量及肝臟指數(shù)比較

2.3 消黃去疸湯對(duì)膽汁淤積大鼠血清中DBil、TBil、TBA水平的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠血清DBil、TBil、TBA水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與MOD組比較,UDCA組與XHQD組大鼠血清DBil、TBil、TBA水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清中DBil、TBil、TBA水平

2.4 消黃去疸湯對(duì)膽汁淤積大鼠血清中SOD活性,GSH、MDA水平的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠血清SOD活性及GSH水平降低、MDA水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與MOD組比較,UDCA與XHQD組大鼠血清SOD活性及GSH水平升高、MDA水平降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠血清中SOD、GSH、MDA及肝臟指數(shù)

2.5 消黃去疸湯對(duì)膽汁淤積大鼠肝臟組織病理變化的影響 NOM組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞索狀排列整齊,肝細(xì)胞間肝竇明顯,未見(jiàn)明顯組織病理?yè)p傷改變。MOD組大鼠肝組織形態(tài)脂質(zhì)樣沉積嚴(yán)重,細(xì)胞核固縮脂肪樣變性,匯管區(qū)周圍有結(jié)締組織增生,伴隨少量零散炎性細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞增生。UDCA組與XHQD組大鼠肝組織匯管區(qū)周圍雖有少量結(jié)締組織增生,可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但病變均有改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理學(xué)改變 (HE染色,上:100×,下:200×)

NOM組大鼠的肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出核膜完整、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體清晰可見(jiàn),結(jié)構(gòu)正常。MOD組大鼠的肝細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞器排列紊亂,脂滴明顯,線粒體水腫,胞質(zhì)空泡化、毛細(xì)膽管微絨毛減少以及膽汁淤積等現(xiàn)象。UDCA組與XHQD組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器的依然有損害現(xiàn)象,但線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞核超微結(jié)構(gòu)病變較輕。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 (透射電鏡,1 700×)

2.6 消黃去疸湯對(duì)膽汁淤積大鼠肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響 與NOM組比較,MOD組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與MOD組比較,UDCA組與XHQD組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表6。

表6 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平

3 討論

隨著飲食結(jié)構(gòu)、生活環(huán)境以及生存壓力變化,情緒的變化嚴(yán)重影響肝膽代謝。中醫(yī)理論認(rèn)為肝主疏泄,情志抑郁引起肝失疏泄,膽汁不能正常排泄,膽汁淤阻、蓄積,過(guò)量膽汁酸在肝內(nèi)積聚,造成肝臟損傷。ANIT可引起肝細(xì)胞和膽道上皮細(xì)胞的損傷和壞死,破壞膽汁酸穩(wěn)態(tài),在嚙齒類動(dòng)物中常用于誘導(dǎo)膽汁淤積,給藥后動(dòng)物模型的生化和病理變化包括轉(zhuǎn)氨酶升高、膽汁酸水平紊亂、肝細(xì)胞凋亡或壞死等,與臨床肝內(nèi)膽汁淤積癥狀相似[7]。

廣泛存在于肝細(xì)胞中的ALT、AST在肝細(xì)胞受損后被釋放到血液中,導(dǎo)致血液中ALT和AST濃度升高。ALT是早期肝損傷的主要指標(biāo),AST升高提示肝細(xì)胞壞死,反映肝損傷程度。ALP和γ-GT升高常見(jiàn)于肝內(nèi)外膽管阻塞性疾病,膽汁淤積性肝損傷時(shí)出現(xiàn)明顯升高[8]。TBil、DBil、TBA是臨床診斷膽汁淤積的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,MOD組大鼠血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)明顯升高,肝臟病理切片觀察到肝細(xì)胞萎縮呈嚴(yán)重長(zhǎng)梭狀形態(tài),肝竇和匯管區(qū)見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),匯管區(qū)見(jiàn)膽管上皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞增生,膽汁體積流量明顯降低,大鼠出現(xiàn)明顯的膽汁淤積。UDCA組及XHQD組大鼠上述指標(biāo)與病理表現(xiàn)均得到明顯改善,且XHQD組大鼠改善程度更好,提示消黃去疸湯能夠改善并修復(fù)大鼠肝細(xì)胞的損傷,促進(jìn)膽汁代謝及排泄,效果優(yōu)于UDCA組。

SOD、MDA及GSH是機(jī)體氧化應(yīng)激及自我修復(fù)的常用指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道SOD活性降低、MDA和GSH水平升高均提示體內(nèi)存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷[9],與本文研究一致。與MOD組相比較,XHQD組大鼠SOD活性提高, MDA和GSH水平降低,提示消黃去疸湯能夠緩解肝組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。肝臟中TNF-α的過(guò)度表達(dá)可誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基以及脂質(zhì)過(guò)氧化,從引起肝損傷[10]。TNF-α作為促炎因子,可激活肝星狀細(xì)胞,同時(shí)可促進(jìn)IL-1β、IL-6等的表達(dá),放大炎癥反應(yīng)[11]。因此,在膽汁瘀積性肝損傷的疾病中IL-6、TNF-α、IL-1β等炎癥因子發(fā)揮重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn),模型大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平升高,XHQD組相應(yīng)指標(biāo)均明顯降低,提示消黃去疸湯能夠改善膽汁淤積肝損傷炎癥反應(yīng)。

總之,消黃去疸湯通過(guò)降低膽汁淤積性肝損傷大鼠的炎癥狀態(tài),改善肝功能水平,調(diào)整氧化應(yīng)激水平,從而起保護(hù)作用。本文為消黃去疸湯的臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)研究提供了數(shù)據(jù)支持,但中藥復(fù)方存在多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),其有效成分及具體機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步研究。