王 瑋 陳 熙 楊淑媚 羅 丹 段雪輝 李啟祥

江門市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 (廣東 江門, 529030)

酒精性肝病(ALD)是全球常見(jiàn)的慢性肝病之一[1]。酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制以肝臟脂肪變性為特征,可發(fā)展為肝硬化和肝癌[2,3]。盡管在研究ALD的機(jī)制方面取得了重大進(jìn)展,但目前尚無(wú)ALD的推薦治療方法。因此,尋找有效的ALD治療藥物極為重要。柚皮素(NAR)是柚子和其他柑橘類水果中的一種豐富的苷元黃酮,具有降血脂[4]和降血糖[5,6]的特性,多項(xiàng)研究表明NAR可以抑制脂肪生成[7]。研究使用3T3-L1細(xì)胞作為脂肪生成系統(tǒng),證明了NAR以劑量依賴性方式特異性抑制脂質(zhì)積累和脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白的誘導(dǎo)[8]。然而,NAR在改善酒精性肝臟脂肪合成代謝功能中的作用和機(jī)制尚未明確。本研究旨在研究NAR對(duì)酒精性肝臟脂肪變性小鼠脂肪合成和代謝等相關(guān)指標(biāo)的調(diào)控作用,并基于沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)/腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)信號(hào)通路探討NAR調(diào)控乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪變性的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與耗材 50只雄性成年KM小鼠購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2018-0002]。乙醇購(gòu)于美國(guó)默克Supelco公司。NAR和白藜蘆醇(RES)均購(gòu)于購(gòu)于美國(guó)Sigma aldrich公司。蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒與油紅O染色試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。Trizol試劑盒與Lipofectamine 3 000試劑均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。RIPA緩沖液購(gòu)于美國(guó)Pierce公司;PrimeScript RT Regent Kit和SYBR Premix Ex Taq購(gòu)于日本Takara公司。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔 IgG購(gòu)于美國(guó)Jackson Immuno Research公司;SuperSignal試劑購(gòu)于美國(guó)Pierce公司;兔抗Sirt1、AMPKα、p-AMPKα和GAPDH的一抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。分光光度計(jì)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司;DAB試劑盒購(gòu)于北京ZSGB-BIO公司。改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)和胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)于中科院細(xì)胞庫(kù)(ATCC)。

1.2 酒精性肝臟脂肪變性模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 50只雄性成年KM小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為Control組、乙醇誘導(dǎo)組(EtOH組)、EtOH+vehicle組、NAR治療組(EtOH+NAR組)、NAR聯(lián)合白藜蘆醇(RES)組(EtOH+NAR+RES組),每組10只。EtOH組小鼠正常飼養(yǎng)1周后,自由飲用乙醇飲料(含15%蔗糖),乙醇濃度梯度設(shè)置為6%、12%、18%、24%、30%、36%、42%,初始乙醇濃度為6%,每周增加一個(gè)梯度直至42%持續(xù)至第12周, EtOH+vehicle組、EtOH+NAR組、EtOH+NAR+RES組小鼠在EtOH組基礎(chǔ)上于1～12周每周分別靜脈注射0.5 ml生理鹽水、0.5 ml NAR(50 mg/kg)、0.5 ml NAR(50 mg/kg)與RES(45 mg/kg)混合物,每周注射1次。

1.3 HE染色 Control組、EtOH組、EtOH+vehicle組、EtOH+NAR組、EtOH+NAR+RES組小鼠處理結(jié)束后24 h腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)處死。用含10%福爾馬林的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)固定肝臟組織。將固定好的標(biāo)本脫水,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,二甲苯脫蠟,經(jīng)過(guò)乙醇(100%、95%、70%和50%)分餾后再水化。清洗后切片按試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行HE染色。乙醇脫水分化后,用BX50光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。每個(gè)切片取自5個(gè)不同區(qū)域(200倍放大)進(jìn)行拍照。

1.4 Western Blot 收集Control組、EtOH組、EtOH+vehicle組、EtOH+NAR組、EtOH+NAR+RES組小鼠的肝臟組織,用冷PBS 洗滌兩次,在冰上用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液進(jìn)行裂解。將細(xì)胞裂解液在4℃下以15 000 g離心15 min以去除細(xì)胞碎片。上清液在含有2% SDS和1%,2-巰基乙醇的上樣緩沖液中,在 95℃加熱5 min。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白裂解物,并使用濕轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移至PVDF膜。膜在室溫下用5%牛奶封閉1 h,然后與兔抗Sirt1(1∶600)、AMPKα(1∶800)、p-AMPKα(1∶500)和GAPDH的(1∶2 000)在4℃下過(guò)夜,然后是辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG孵育4 h。電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)用于顯示蛋白條帶,ImageJ -lab 3.0版用于分析條帶強(qiáng)度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 脂肪合成標(biāo)志物SREBP1、FASN、ACC、SCD1和脂肪酸β氧化標(biāo)志物PPARα、CPT1α、UCP2的mRNA表達(dá),即Sirt1和AMPK的mRNA表達(dá)使用qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行操作,通過(guò)Trizol試劑收集肝臟組織的總RNA。通過(guò) PrimeScript RT Regent Kit從1 mg RNA中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒在ABI 7 500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。引物如下(5′-3′):SREBP1-FCCTTGGA-TACAAACTCTGCCCTTT;SREBP1RCGCTTTGGTGTTGTAATCA-CA;FASN-FTTCCTCCGTCTCCACTTA;FASN-RGCGAAGCCTT-GCCATACA;ACCFATC-ATGGCCGAGTGGATAGT;ACCRGCC-ATTCAACTCCTTGCTTT;SCD1-FAGCCAACGTGCAGCCT-TTGT;SCD1-RTC-GCCTGGCTCTCTCCACT;PPARα-FTCACCACGTTC-CAGCGTCTAG;PPARα-RAGCTCTTCCAGTATCGCCTCC。CPT1α-FAG-GCACAAARGAARGCCATAC;CPT1α-RATTGACTGA-GGGAAGGGT。UCP2-FAGACCGTCCAAGTCCGAGAAC;UCP2-RCAGGTTACGACGCC-GFAAGTGGA。2-△△CT的計(jì)算公式如下:△Ct= Ct目的基因-Ct內(nèi)參,記為△Ct對(duì)照,用各組的△Ct分別減去△Ct對(duì)照平均,求得△△Ct值,再計(jì)算各組2-△△CT值,即為各組中基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 用D-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2,培養(yǎng)基補(bǔ)充10% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml 鏈霉素,HepG2在37℃含有5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用生理鹽水(NC)、2.5 mg/L NAR、2.5 mg/L的NAR與2.0 mg/L RES混合物分別處理HepG2細(xì)胞,分組為NC組,NAR組,NAR+RES組。通過(guò)qRT-PCR觀察細(xì)胞中脂肪合成與代謝相關(guān)標(biāo)志物的變化。

1.7 透射電鏡 采用透射電子顯微鏡觀察小鼠肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞脂肪滴形成。將肝組織用2.5%戊二醛4℃固定2 h,1%四氧化鋨4℃固定1 h,脫水,環(huán)氧樹脂包埋。組織切片采用超切片機(jī)(RMC/MTX;Elexience)。將超薄切片(60～80 nm)安裝在銅網(wǎng)上,與8%的醋酸鈾酰和檸檬酸鉛對(duì)比,使用Philips CM100透射電子顯微鏡和TENGRA 2.3 K×2.3 K TEM相機(jī)進(jìn)行觀察,成像后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠肝臟脂肪變性情況 從HE染色結(jié)果可看出,與Control組相比,EtOH組小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積顯著增加(脂質(zhì)沉積的HE染色呈非常明顯的空泡狀)。NAR治療后,與EtOH+vehicle組比,EtOH+NAR組的肝臟組織脂質(zhì)沉積明顯減少。見(jiàn)圖1。

圖1 4組小鼠肝臟脂肪變性圖 (HE染色,200×)

2.2 4組小鼠肝臟中Sirt1/AMPKα信號(hào)通路表達(dá) 與Control組相比,EtOH組小鼠的Sirt1和AMPK mRNA水平明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且Sirt1和p-AMPKα(Thr172)/AMPKα的蛋白表達(dá)水平顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR組、EtOH組小鼠Sirt1和AMPK mRNA水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且Sirt1和p-AMPKα(Thr172)/AMPKα蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 4組小鼠肝臟Sirt1/AMPKα信號(hào)通路蛋白表達(dá)圖 A:qRT-PCR檢測(cè)Sirt1和AMPK的mRNA水平;B:Western Blot檢測(cè)Sirt1和AMPKα的蛋白水平和定量分析。與Control比,*P<0.05;與EtOH+vehicle比,#P<0.05

2.3 3組小鼠肝臟脂肪變性情況 使用Sirt1/AMPKα信號(hào)的激活劑RES與NAR聯(lián)合處理EtOH組小鼠,與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積變化不明顯(空泡狀細(xì)胞),而與EtOH+NAR組比,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積明顯增加。見(jiàn)圖3。

圖3 3組小鼠肝臟脂肪變性圖 (HE染色,200×)

2.4 5組小鼠肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況 與Control組比較,EtOH組小鼠肝臟脂肪形成基因SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達(dá)均顯著增高,而脂肪酸的β-氧化相關(guān)基因PPARα、CPT1α、UCP2的表達(dá)均顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NAR治療后,與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR組小鼠肝臟SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達(dá)均顯著減少,PPARα、CPT1α、UCP2的表達(dá)均顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RES與NAR聯(lián)合處理EtOH組小鼠,與EtOH+vehicle組比較,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟SREBP1、FASN、ACC、SCD1、PPARα、CPT1α、UCP2的表達(dá)差異不明顯(P>0.05)。與EtOH+NAR組比較,EtOH+NAR+RES組小鼠肝臟SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達(dá)增高,PPARα、CPT1α、UCP2的表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 5組小鼠脂肪合成代謝基因表達(dá)圖

2.5 柚皮素通過(guò)抑制Sirt1/AMPKα信號(hào)通路減少HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)變性 采用HepG2細(xì)胞系進(jìn)一步在體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用Sirt1/AMPKα信號(hào)通路激活劑RES(0.5 μmol/L)處理HepG2細(xì)胞24 h。透射電鏡顯示,與NC組比較,RES組細(xì)胞脂質(zhì)積累顯著增加(P<0.05),SREBP1、FASN、ACC、SCD1表達(dá)增高,PPARα、CPT1α、UCP2表達(dá)降低(P<0.05)。與RES組比較,NAR+RES組細(xì)胞脂質(zhì)積累顯著降低(P<0.05),SREBP1、FASN、ACC、SCD1表達(dá)減少,PPARα、CPT1α、UCP2表達(dá)增加(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 3組HepG2細(xì)胞脂肪合成圖

3 討論

本研究結(jié)果表明,NAR通過(guò)抑制Sirt1/AMPKα信號(hào)通路激活,明顯改善酒精性肝臟脂肪變性,提示NAR可能是有效治療ALD的潛在藥物。以往研究表明NAR可影響脂肪生成及前脂肪細(xì)胞的早期增殖[6,9,10]。然而,NAR對(duì)酒精性肝臟脂肪變性的作用尚未明確。本研究觀察到乙醇誘導(dǎo)肝臟脂肪變性小鼠的肝臟組織中脂質(zhì)沉積顯著增加,使用NAR治療后小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積明顯減少。為分析NAR對(duì)脂質(zhì)沉積的影響,通過(guò)電鏡觀察HepG2細(xì)胞中脂肪合成變化,NAR對(duì)脂肪合成的作用與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致。以往研究監(jiān)測(cè)到在誘導(dǎo)脂肪生成后的不同時(shí)間點(diǎn)添加NAR均可以抑制脂肪細(xì)胞發(fā)育,能夠明顯減弱脂肪生成;NAR還可以抑制完全分化的脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素敏感的葡萄糖攝取[6,11]。這表明NAR可能對(duì)肝臟組織脂肪代謝具有改善作用。本研究提供了NAR調(diào)節(jié)肝臟臟組織中脂肪代謝的新依據(jù)。

本研究還發(fā)現(xiàn)NAR可以抑制肝臟脂肪變性小鼠的Sirt1/AMPKα信號(hào)通路。據(jù)報(bào)道,Sirt1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的蛋白去乙酰酶[12],可以直接使脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)去乙?；痆13,14],研究表明,在FK866處理的高脂肪飲食小鼠中Sirt1的表達(dá)減少[15]。本研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝臟脂肪變性小鼠Sirt1表達(dá)明顯增加,而NAR治療后Sirt1表達(dá)明顯減少。AMPK是細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子[16]。Sirt1通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞和動(dòng)物模型中AMPK的主要上游激酶Lkb1來(lái)調(diào)節(jié)AMPK活性[17],反之,AMPK通過(guò)增加細(xì)胞NAD+水平來(lái)增強(qiáng)Sirt1活性[18]。本研究提供了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù),表明NAR顯著降低了酒精性脂肪變性小鼠肝臟中AMPKα的磷酸化(Thr172)水平。而且,脂肪形成基因SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達(dá)都明顯降低,脂肪酸的β-氧化相關(guān)基因PPARα、CPT1α、UCP2的表達(dá)都明顯增加。表明NAR具有抑制Sirt1/AMPKα信號(hào)通路的作用,從而在抑制肝臟脂肪合成促進(jìn)脂肪代謝中發(fā)揮重要作用。使用Sirt1/AMPKα信號(hào)的激活劑RES可以明顯抑制NAR的作用,首先是肝臟組織脂質(zhì)沉積明顯增加,其次脂肪形成基因SREBP1、FASN、ACC、SCD1的表達(dá)都明顯增高,而脂肪酸的β-氧化相關(guān)基因PPARα、CPT1α、UCP2的表達(dá)都明顯減少。采用HepG2細(xì)胞系進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果,結(jié)果表明NAR可以明顯抑制HepG2細(xì)胞中的脂質(zhì)積累,而且脂肪形成基因的表達(dá)減少,脂肪酸的β-氧化相關(guān)基因的表達(dá)都明顯增加。

綜上所述,本研究證明NAR通過(guò)Sirt1/AMPKα信號(hào)通路介導(dǎo)的脂肪合成和代謝調(diào)節(jié)功能來(lái)抑制酒精性肝臟脂肪變性的假設(shè)。EtOH激活Sirt1/AMPKα信號(hào)通路,并損害了肝臟脂肪代謝的正常進(jìn)行,導(dǎo)致小鼠肝臟脂肪變性。柚皮素能夠改善肝臟中的脂質(zhì)變性,可以作為潛在的治療酒精性肝臟疾病的藥物。本研究已經(jīng)明確肝臟脂肪代謝受損可能與Sirt1/AMPKα信號(hào)通路激活密切相關(guān)。因此,靶向Sirt1/AMPKα信號(hào)通路的激活可能是預(yù)防和治療ALD的新途徑。