余 飛，楊麗娜，韋必曉，蘭貴斌，黃艷云

（百色市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心1，檢驗科2，廣西 百色 533000）

腦卒中（stroke）具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點，已成為我國僅次于惡性腫瘤和心臟病的第三位死亡原因，也是我國成年人殘疾的首要原因，給我國的醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來了巨大的疾病負擔(dān)[1]。由于一直缺乏有效的治療手段，早期發(fā)現(xiàn)危險因素并積極控制是有效預(yù)防腦卒中發(fā)生的關(guān)鍵。近年來的廣泛研究表明，血液中同型半胱氨酸（Hcy）濃度升高會增加中風(fēng)的風(fēng)險，高Hcy 水平是中風(fēng)的一個新的、獨特的危險因素[2，3]。人體內(nèi)高Hcy 水平與缺乏參與Hcy 和B 族維生素代謝的酶、葉酸、維生素輔助因子缺乏、年齡及藥物使用等因素有關(guān)[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）即是參與Hcy 代謝的關(guān)鍵酶之一。MTHFR 在維生素B2的輔助下催化5，10-亞甲基四氫葉酸使之還原為具有生物學(xué)活性的5-甲基四氫葉酸，并將此過程中產(chǎn)生的甲基提供給Hcy，實現(xiàn)Hcy 再甲基化向蛋氨酸的轉(zhuǎn)變，在調(diào)節(jié)人體葉酸和Hcy 水平方面扮演著重要的角色[2]。多項研究顯示[4-6]，MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性TT 基因型與缺血性卒中（IS）和出血性卒中（HS）發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)，并在這些卒中患者血清中有著更高的Hcy 水平，有望成為腦卒中預(yù)防診斷及早期治療的生物學(xué)標記物。然而，由于檢測方法的不同、研究方案的設(shè)計、樣本量大小以及677C/T 位點多態(tài)性在不同地域、種族和民族中具有較大的差異等問題，該結(jié)論在部分地區(qū)的有關(guān)研究中沒有得以再現(xiàn)，出現(xiàn)與上述研究不一致的結(jié)論[7，8]。鑒于此，且截至目前國內(nèi)外尚未查閱到有關(guān)桂西地區(qū)人群MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性與腦卒中遺傳易感性方面的文獻報道。因此，本次研究擬以桂西地區(qū)人群為研究對象，探討MTHFR 基因677C/T 位點多態(tài)性在健康人與IS 和HS 患者中的分布情況，分析其多態(tài)性與不同臨床類型腦卒中及血清Hcy 水平的相關(guān)性，并評價Hcy 作為腦卒中危險因子的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月-2022 年1 月在百色市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院并確診為腦卒中患者的標本1413 例。腦卒中診斷標準依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會制定的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》和《中國腦出血診治指南2014》執(zhí)行。經(jīng)臨床表現(xiàn)、實驗室及影像學(xué)等檢查綜合確立腦卒中診斷，并按照上述指南將腦卒中患者分為缺血性卒中（IS）組（945 例）和出血性卒中（HS）組（468 例）。收集同期在百色市人民醫(yī)院體檢中心體檢的735 例健康者作為對照組，均體健且無心腦血管疾病史。所納入的研究對象均已排除顱內(nèi)感染、各系統(tǒng)惡性腫瘤、血液病、自身免疫性疾病、感染性疾病以及嚴重的肝臟、腎臟、心臟等疾病。所有研究對象均為無血緣關(guān)系的桂西地區(qū)人群。本研究方案是在百色市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準下實施，研究對象均對本研究知情同意。

1.2 主要儀器和試劑 ABI7500 實時熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾公司）；TBA-FX8 Canon 全自動生化儀[佳能醫(yī)療系統(tǒng)（中國）有限公司]；亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測試劑盒（深圳泰樂德醫(yī)療有限公司)；同型半胱氨酸（Hcy）測定試劑盒（北京安圖生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基本信息采集 采集所有研究對象年齡、性別、戶籍等人口學(xué)信息、腦卒中類型以及血脂四項檢測結(jié)果。

1.3.2 血清Hcy 水平檢測 使用無抗凝劑的真空采血管，采集所有受試者清晨空腹12 h 靜脈血3～5 ml，室溫靜置30 min 后4 ℃3500 r/min 離心5 min，取上層血清置入TBA-FX8 Canon 全自動生化分析儀，采用循環(huán)酶法檢測血清中Hcy 濃度。

1.3.3 MTHFR 基因677C/T 位點多態(tài)性檢測 采用EDTA-K2 抗凝真空采血管，采集受試者外周靜脈血2 ml。應(yīng)用深圳泰樂德醫(yī)療有限公司的亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）進行基因檢測，嚴格按照試劑說明書進行實驗操作和結(jié)果判斷。

1.4 觀察指標 比較IS 組、HS 組及對照組一般臨床資料、基因多態(tài)性分布和血清Hcy 水平；比較MTHFR基因677C/T 位點多態(tài)性在三組男、女性別上的分布差異；比較各組內(nèi)不同基因型血清Hcy 水平的差異；比較各組之間相同基因型血清Hcy 水平的差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用χ2檢驗分析各組的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡定律。計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料先進行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布且方差齊則采用t檢驗或方差分析，數(shù)據(jù)集中趨勢和離散程度以（）表示；不服從正態(tài)分布則應(yīng)用秩和檢驗，以[M（P25，P75）]表示，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IS 組、HS 組與對照組一般臨床資料比較 三組年齡和性別構(gòu)成比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IS 組血清甘油三酯（TG）水平高于對照組和HS 組，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平低于對照組和HS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；三組總膽固醇（TCH）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。HS 組血清TG 水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），TC、HDL-C及LDL-C 水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 IS 組、HS 組與對照組一般臨床資料比較[M（P25，P75），n（%）]

2.2 MTHFR 基因677C/T 位點多態(tài)性在IS 組、HS 組及對照組的遺傳平衡評估 在IS 組、HS 組及對照組中，677C/T 位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05），說明所選研究樣本來自同一孟德爾群體，能夠反映677C/T 位點在目標人群中的分布情況，適合進行遺傳學(xué)統(tǒng)計分析，見表2。

表2 MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性的Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗（n）

2.3 IS 組、HS 組及對照組MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性分布和血清Hcy 水平比較 MTHFR 基因677C/T位點基因型和等位基因頻率分布在IS 組、HS 組及對照組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IS 組和HS 組血清Hcy 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IS 組與HS 組血清Hcy 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 IS 組、HS 組及對照組677C/T 位點多態(tài)性分布和血清Hcy 水平比較[n（%），M（P25，P75）]

2.4 不同性別MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性在IS 組、HS 組及對照組比較 男性、女性MTHFR 基因677C/T 位點基因型和等位基因頻率分布在IS 組、HS 組及對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 不同性別MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性在IS 組、HS 組及對照組比較[n（%）]

2.5 MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性與血清Hcy 水平的相關(guān)性分析 三組CC、CT 及TT 基因型Hcy 水平整體呈增高趨勢，均以TT 型最高，CT 型次之，CC 型最低。IS 組和HS 組中，攜帶TT 基因型的患者血清Hcy 水平高于攜帶CC、CT 基因型的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），攜帶CT 基因型的患者血清Hcy水平與攜帶CC 基因型的患者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在對照組中，各基因型的血清Hcy 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IS 組和HS 組各基因型對應(yīng)的血清Hcy 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。IS 組CC、CT 及TT 基因型血清Hcy 水平與HS 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5、圖1、圖2。

圖1 MTHFR 677C/T 各基因型血清Hcy 水平組內(nèi)比較

圖2 MTHFR 677C/T 各基因型血清Hcy 水平組間比較

表5 對照組、IS 組及HS 組677C/T 基因型血清Hcy 水平比較[M（P25，P75），μmol/L]

3 討論

MTHFR 在人體內(nèi)維持Hcy 較低水平方面發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MTHFR 基因677C/T位點的堿基C 突變?yōu)閴A基T 后，其編碼的MTHFR活性及穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致5，10-亞甲基四氫葉酸不能有效地向Hcy 提供甲基，使得Hcy 無法正常完成向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥（HHcy）[9]。而HHcy 可通過不同的致病機制導(dǎo)致腦卒中的發(fā)生[2]。于是，研究者們推測，MTHFR 基因677C/T 位點多態(tài)性可能影響Hcy 水平與腦卒中的易感性相關(guān)。近十年來，二者的相關(guān)性在腦血管疾病領(lǐng)域得到了大量的研究，但結(jié)論卻不盡一致。部分研究數(shù)據(jù)表明，677C/T 位點TT 基因型與缺血卒中發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)[4，5，10]，而另一些研究卻表明二者之間無相關(guān)性[7，11，12]。有研究提示，667C/T 基因多態(tài)性與HS 風(fēng)險增加相關(guān)，T 等位基因可能是HS 的重要危險因素[6]，而另有研究卻表明667C/T 位點多態(tài)性與摩洛哥患者HS 的易感性之間沒有關(guān)聯(lián)[9]。這種結(jié)論不一致現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在不同種族人群之間，同一種族不同地區(qū)、不同民族甚至不同性別人群之間也會出現(xiàn)[5，7，11-13]。因此，有必要在本地區(qū)人群中開展二者的相關(guān)研究。

本研究結(jié)果顯示，桂西地區(qū)人群MTHFR 基因677C/T 位點的基因型和等位基因頻率分布在IS組、HS 組和對照組之間基本一致，提示桂西地區(qū)人群677C/T 位點多態(tài)性與IS 及HS 的發(fā)病風(fēng)險不存在相關(guān)性，即桂西地區(qū)人群患IS 及HS 的風(fēng)險與其攜帶的677C/T 位點基因型無關(guān)。鑒于性別與腦卒中的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，且有文獻報道677C/T 位點多態(tài)性與腦卒中發(fā)病風(fēng)險存在性別上的差異[5]。本研究在IS 組、HS 組和對照組進行677C/T 位點多態(tài)性基于性別的比較。遺憾地是，桂西地區(qū)人群677C/T 位點多態(tài)性與腦卒中的發(fā)病風(fēng)險不存在性別上的差異，且與腦卒中的發(fā)病風(fēng)險無關(guān)。本研究結(jié)果與國內(nèi)外的部分研究結(jié)果是一致的[7，8，11，12]，但與報道的大部分研究結(jié)果不一致[4-6]。導(dǎo)致這些研究結(jié)果不一致的原因尚不明確，可能的原因考慮以下幾點：①677C/T位點變異頻率在不同地域、種族人群中存在較明顯的異質(zhì)性。國際人類基因組單體型圖（HapMap）計劃公布的SNP 分型數(shù)據(jù)顯示，T 等位基因在歐洲（31.0%）、日本（36.0%）、墨西哥（42.0%）人群中出現(xiàn)頻率較高，在印第安（17.0%）、非洲（9.3%）人群中頻率較低。在我國，T 等位基因頻率是由南向北漸進增高，其中，河北人群高達59.0%，而桂西地區(qū)人群僅為22.2%，與南寧24.2%（桂南地區(qū)）相當(dāng)[14]。677C/T位點變異體的這種異質(zhì)性有可能因研究的群體不同而導(dǎo)致對腦卒中的易感性不同；②樣本量大小不一，小樣本量的研究不排除偏倚的存在；③研究方案的設(shè)計，例如研究對象的納入標準及把控程度、信息的完整性以及檢測方法的選擇等；④社會經(jīng)濟差異，經(jīng)濟實力強、醫(yī)療條件好的國家在腦卒中的預(yù)防措施方面更全面、效果更顯著，從而降低腦卒中的發(fā)病率，影響遺傳因素對疾病的作用[15]；⑤生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣等不同，腦卒中是一種多因素疾病，涉及許多基因和環(huán)境因素之間的相互作用，不良生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣如缺乏運動、吸煙、酗酒以及高鹽高脂高糖飲食等可能協(xié)同遺傳因素增強對疾病的影響[16，17]。

鑒于Hcy 與和MTHFR 之間存在明顯的代謝聯(lián)系，本研究對各組血清Hcy 水平進行比較，并分析了MTHFR 基因677C/T 多態(tài)性對血清Hcy 水平的影響。研究結(jié)果顯示，IS 組和HS 組患者的Hcy 水平高于對照組，血清Hcy 高水平與IS 和HS 的發(fā)生密切相關(guān)，這與既往的研究結(jié)果一致[2]，進一步支持血清Hcy 水平升高在腦卒中的發(fā)生中起著重要作用。IS組和HS 組中，攜帶TT 基因型的患者血清Hcy 水平高于攜帶CC、CT 基因型的患者，提示677C/T 多態(tài)性與血清Hcy 水平存在相關(guān)性，TT 基因型可能是IS 和HS 患者血清Hcy 水平升高的危險因素，與既往的大多數(shù)研究結(jié)果一致[12，13]。但在對照組中沒有發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)，原因可能是Hcy 在人體血清中的水平不僅受到遺傳因素（如參與其代謝的MTHFR、MTRR 等）的影響，還受到環(huán)境因素的影響（年齡、男性、吸煙、高血壓、糖尿病、種族、藥物使用、運動耐力和水果和蔬菜攝入量）[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[18]，當(dāng)血漿葉酸低于15.0 ng/ml 水平時，677C/T 位點TT 基因型參與者的血漿Hcy 水平明顯高于CC、CT 基因型參與者，而在葉酸水平高于15.0 ng/ml，不同基因型的Hcy 水平差異消失。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，IS 組和HS組各基因型的血清Hcy 水平均高于對照組，而IS 組與HS 組各基因型血清Hcy 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這可能與高血壓、糖尿病、藥物的使用以及葉酸和B 族維生素的缺乏等環(huán)境風(fēng)險因素協(xié)同遺傳因素增加了IS 和HS 患者的血清Hcy水平有關(guān)[18-20]。

本研究有一定的局限性：首先，僅檢測677C/T位點，然而基因?qū)膊〉淖饔檬清e綜復(fù)雜的，單一677C/T 位點變異對腦卒中的發(fā)生所起的作用可能不大，不能排除這樣一種可能性，即當(dāng)將677C/T 多態(tài)性納入其他特定的遺傳或環(huán)境風(fēng)險因素時，其預(yù)測腦卒中的能力將顯著增強。其次，研究對象均來自醫(yī)院，選擇偏倚不可避免。最后，桂西地區(qū)除壯族外，還有漢、瑤、苗等多個少數(shù)民族，民族之間是否存在多態(tài)性差異而導(dǎo)致結(jié)果偏差尚未可知。

綜上所述，桂西地區(qū)人群腦卒中的發(fā)生與血清Hcy 水平密切相關(guān)，MTHFR 基因677C/T 位點TT 基因型是腦卒中患者血清Hcy 水平升高的風(fēng)險因素，但該位點的多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生無相關(guān)性。結(jié)合677C/T 位點檢測結(jié)果，加強Hcy 及血脂管理，可能在早期預(yù)防和及時治療方面降低腦卒中的發(fā)生率及復(fù)發(fā)率。但鑒于本次研究的局限性，桂西地區(qū)人群MTHFR677C/T 多態(tài)性與腦卒中的相關(guān)性還需要多中心做進一步地深入研究。