謝淑君，袁海靜，范婷婷，楊宏光

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院血液腫瘤科，廣東 廣州 510378）

重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是一種復(fù)雜的、多因素的、高度異質(zhì)性的精神疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)成人抑郁障礙終生患病率高達(dá)6.8%[1]，其中重度抑郁癥在青少年中的發(fā)病率高達(dá)4.8%[2]，MDD 因高患病率和致殘率，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。目前抗抑郁藥仍是重度抑郁癥的一線治療手段，但起效較慢且效果有限[3]。中醫(yī)藥可通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)、多層次發(fā)揮抗抑郁作用，在抑郁癥的治療上具有不可替代的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[4]。六郁湯出自《醫(yī)學(xué)正傳》，由半夏、陳皮、蒼術(shù)、川芎、茯苓、梔子、香附、炙甘草、砂仁組成。研究證據(jù)顯示，六郁湯具有抗抑郁[5，6]、改善抗精神病藥所致的代謝綜合征等作用[7]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究聯(lián)合GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法探討六郁湯輔助治療重度抑郁癥的潛在機(jī)制，以期為重度抑郁癥的治療用藥提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 六郁湯活性成分及靶點(diǎn) 篩選基本藥物的ADME 模型，設(shè)置“口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18”為篩選指標(biāo)[8]，分別以“陳皮、半夏、蒼術(shù)、川芎、茯苓、梔子、香附、甘草、砂仁”為檢索詞，檢索中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，https://tcmsp-e.com/），獲取六郁湯主要活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)；運(yùn)用Perl 腳本（https://www.perl.org/）結(jié)合UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）中已驗(yàn)證的人類基因?qū)Τ煞职悬c(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 MDD 潛在作用靶點(diǎn)篩選 利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“Major depressive disorder ”為檢索詞，獲取序列號(hào)為GSE76826 的基因芯片矩陣和注釋文件。此芯片為32 個(gè)血液樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，其中20 個(gè)來(lái)自MDD 患者（試驗(yàn)組），12 個(gè)來(lái)自健康人群（對(duì)照組）。使用R 語(yǔ)言limma 對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析獲取MDD患者與健康人的差異表達(dá)基因（|logFC|＞0.05，P＜0.05）。按照P值篩選前20 個(gè)差異基因繪制基因熱圖和火山圖。以“Major depressive disorder”為檢索詞，逐一檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://db.idrblab.net/ttd/）、Genecards 數(shù)據(jù) 庫(kù)（http://www.genecards.org）、Durgbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.pharmgkb.org），獲取MDD 相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 繪制疾病靶點(diǎn)韋恩圖 將六郁湯活性成份靶點(diǎn)、GEO 差異基因、MDD 相關(guān)靶點(diǎn)基因去除重復(fù)值后，通過(guò)Venny2.1 在線工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），獲得上述靶基因交集的韋恩圖。

1.4 六郁湯治療MDD“活性成分-靶點(diǎn)基因”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建 運(yùn)用Perl 語(yǔ)言將“1.3”項(xiàng)獲得的交集基因與“1.1”項(xiàng)獲得的成分靶點(diǎn)基因相互映射，獲得交集基因相對(duì)應(yīng)的活性成分；借助Cytoscape3.9.0 軟件進(jìn)行可視化分析，繪制出六郁湯治療MDD 的“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化分析 使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/，Version:11.5），構(gòu)建“1.3”項(xiàng)下的交集基因PPI 網(wǎng)絡(luò)。選擇“Homo sapiens”，設(shè)置最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)選擇為0.400 導(dǎo)出TSV 文件。再利用Cytoscape3.9.0 插件cytoNCA 對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得PPI 核心子網(wǎng)絡(luò)。

1.6 六郁湯與MDD 的GO 功能和KEGG 信號(hào)通路分析 運(yùn)用R 軟件安裝Bioconductor 平臺(tái)(https://www.bioconductor.org/，Version3.14）數(shù)據(jù)包org.Hs.eg.db 對(duì)基因進(jìn)行編碼，將“1.3”項(xiàng)獲得的交集靶基因轉(zhuǎn)換成entrezID；使用R 語(yǔ)言進(jìn)行交集靶點(diǎn)基因的G和KEGG 富集分析，設(shè)置閾值校正P＜0.05，并繪制GO 和KEGG 的氣泡圖。

1.7 分子對(duì)接 從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載活性成分2D 結(jié)構(gòu)文件，保存為“SDF”格式，導(dǎo)入Chem3D 20.0 軟件進(jìn)行能量最小化處理，輸出為mol2 格式文件，作為小分子配體。根據(jù)分子模擬建模靶標(biāo)結(jié)構(gòu)的選擇原則，以“Homo sapiens”“X -RAY DIFFRACTION”、REFINEMENT RESOLUTION（?）≤2.5”為篩選標(biāo)準(zhǔn)[11]，從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）中下載度值排名前5 的核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)基因ID 的PDB 格式文件。利用PyMOL 軟件對(duì)對(duì)接受體進(jìn)行處理后，再借助AutoDock Tools1.5.7 軟件進(jìn)行加氫處理，保存為pdbqt 格式文件。使用AutoDock Vina1.1.2 軟件完成分子對(duì)接，以對(duì)接結(jié)合能并作為對(duì)接評(píng)價(jià)指標(biāo)。使用PyMOL 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 六郁湯活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得六郁湯活性成分184 個(gè)；其中半夏活性成分13 個(gè)、蒼術(shù)9 個(gè)、川芎7 個(gè)、茯苓35 個(gè)、陳皮5 個(gè)、甘草92 個(gè)、砂仁10 個(gè)、香附18 個(gè)、梔子15 個(gè)。刪除重復(fù)，最終獲得168 種活性成分。將活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與UniProtKB 數(shù)據(jù)庫(kù)中已認(rèn)證的人類基因進(jìn)行映射，刪除重復(fù)，最終得到244 個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.2 MDD 潛在作用靶點(diǎn) 借助R 語(yǔ)言對(duì)GSE76826芯片數(shù)據(jù)分析，以|logFC|＞0.05，P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得健康受試者和MDD 患者差異表達(dá)基因808 個(gè)（上調(diào)基因272 個(gè)，下調(diào)基因536 個(gè)），差異基因火山圖見(jiàn)圖1，表達(dá)譜見(jiàn)圖2。以“Major depressive disorder”為檢索詞分別在GeneCard、PharmGKB、DrugBank、OMIM、TTD 5 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得MDD 靶點(diǎn)基因1268、138、104、229、57 個(gè)，合并去重后共1494 個(gè)。

圖1 MDD 患者GEO 差異基因火山圖

圖2 MDD 患者GEO 差異基因表達(dá)譜

2.3 六郁湯與MDD 靶點(diǎn)基因韋恩圖 將244 個(gè)六郁湯活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)基因、808 個(gè)MDD 差異基因、1494 個(gè)MDD 靶點(diǎn)基因上傳至Venny2.1 在線軟件，共獲取117 個(gè)交集靶點(diǎn)基因，見(jiàn)圖3。

圖3 六郁湯與MDD 靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 “活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將117 個(gè)交集靶標(biāo)基因及其對(duì)應(yīng)的活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.9.0軟件構(gòu)建“活性成分-MDD 靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，得到238 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1134 條，見(jiàn)圖4。借助Analyze Network插件分析得到Degree（DC）值，并根據(jù)Degree 值進(jìn)行排序，其中排名前5 的活性成分：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、7-甲氧基-2 甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、四氫帕馬?。℉yndarin）。

圖4 六郁湯-MDD“活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將117 個(gè)六郁湯與MDD 共同靶點(diǎn)基因，導(dǎo)入String11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖5，得到117 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1591 條邊。使用Cytoscape 軟件中的cytoNCA 插件對(duì)PPI 的tsv 文件進(jìn)行拓?fù)浞治?，選擇參數(shù)均大于BC、DC、CC、EC、LAC、NC 中位值的基因作為核心靶點(diǎn)，依此為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行2 次篩選，最終得16 個(gè)核心靶點(diǎn)基因。其中AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP9 為度值排名前5 的靶點(diǎn)基因，見(jiàn)表1。

表1 核心靶點(diǎn)拓?fù)湫畔⒈?/p>

圖5 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點(diǎn)篩選圖

2.6 GO 分析和KEGG 分析 在2372 條GO 功能富集條目中，涉及外源刺激反應(yīng)、體液調(diào)節(jié)、脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來(lái)源分子反應(yīng)等生物過(guò)程（BP）；其中細(xì)胞組分CC 主要包括膜筏、膜微區(qū)、突觸后膜等；分子功能MF 主要涉及G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、突觸后、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等。根據(jù)校正后P值列舉各類排名前10 的生物學(xué)功能條目，見(jiàn)圖6。

圖6 GO 功能富集分析氣泡圖

164 條KEGG 通路富集主要涉及脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGEPI3K-Akt 信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17（IL-17）等信號(hào)通路等。排名前30 位KEGG 通路輸出氣泡圖及KEGG 富集通路靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 KEGG 富集分析氣泡圖

圖8 KEGG 富集通路靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（續(xù)）

圖8 KEGG 富集通路靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接 度值排名前5 的核心靶點(diǎn)AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP 與對(duì)應(yīng)的活性成分分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖9。核心靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分的結(jié)合自由能均≤-6 kcal/mol，構(gòu)象穩(wěn)定，相互作用較強(qiáng)。其中度值排名第1 的槲皮素與5 個(gè)核心靶點(diǎn)均有很好的結(jié)合活性，結(jié)合能均≤-7 kcal/mol。MMP9 與度值排名第2 的木犀草素結(jié)合活性最好，氫鍵結(jié)合能為-11.1 kcal/mol。選擇與槲皮素及木犀草素均有作用的靶點(diǎn)（AKT1、TP53、CASP3、MMP9）的對(duì)熱圖予以展示，見(jiàn)圖10。

圖9 分子對(duì)接熱圖

圖10 分子對(duì)接圖

3 討論

重度抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇，元代著名醫(yī)家朱丹溪基于“凡郁皆在中焦”理論，首倡“氣、血、痰、火、濕、食”六郁學(xué)說(shuō)，并獨(dú)創(chuàng)名方“六郁湯”治諸郁[8]。六郁湯是治諸郁的基本方，方中蒼術(shù)、川芎總解諸郁；川芎，治血郁；香附行氣解郁，治氣郁；半夏、陳皮理氣化痰，治痰郁；茯苓、蒼術(shù)，燥濕運(yùn)脾，兼治濕郁；砂仁化濕開(kāi)胃，宣暢中焦，治食郁；梔子清熱瀉火，治火郁；甘草調(diào)和諸藥。臨床研究顯示[5]，六郁湯可有效改善抑郁癥狀，但目前相關(guān)機(jī)制研究較少。

本研究結(jié)果顯示，在六郁湯168 中有效成分中，槲皮素、木犀草素、山奈酚等為作用靶點(diǎn)最多的核心有效成分。槲皮素（Quercetin）、木犀草素（Luteolin）、山奈酚（Kaempferol）均屬于天然黃酮類化合物，均具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)及抗抑郁作用[9，10]，也是香附、梔子、甘草的主要活性成分。Adeoluwa OA 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3/NF-κB/iNOS 信號(hào)通路抑制神經(jīng)炎癥，消除脂多糖誘導(dǎo)的抑郁樣癥狀。木犀草素的抗抑郁活性與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激[11]、調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和自噬[12，13]有關(guān)。山奈酚可顯著抑制CUMS 抑郁癥模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，并降低凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Caspase-3 的表達(dá)等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；同時(shí)還能顯著抑制IL-1β、TNF 等炎性因子表達(dá)，抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生[14]。六郁湯中的其他有效成分如漢黃芩素（Wogonin）、黃芩甙元（baicalein）等均有抗抑郁活性，漢黃芩素被認(rèn)為可用于抑郁治療的新的有效和可逆的MAO-A 抑制劑[15]黃芩苷可通過(guò)抑制toll 樣受體4（TLR4）的表達(dá)來(lái)改善抑郁小鼠神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的抑郁癥狀，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT/FoxO1 通路有關(guān)[16]。

AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP9 等為六郁 湯治療MDD 的核心靶點(diǎn)基因。AKT1 為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的重要亞型，其多態(tài)性與抑郁患者的抑郁嚴(yán)重程度、自殺傾向、抗抑郁治療反應(yīng)、認(rèn)知功能損傷等密切相關(guān)[17，18]。促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的多效性已被認(rèn)為與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和病因有關(guān)[19，20]。IL1B 基因位點(diǎn)rs16944、rs116343 多態(tài)性與抑郁癥發(fā)病及不同治療預(yù)后反應(yīng)具有密切關(guān)聯(lián)[21]。TP53 又稱為抑癌基因、促凋亡蛋白，廣泛參與響應(yīng)不同形式的急性損傷和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)元死亡?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）被認(rèn)為是重度抑郁癥的主要標(biāo)志物之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、參與突觸形成及突觸可塑性等途徑[22，23]，發(fā)揮抗抑郁作用。Caspase-3 蛋白是Caspases 家族中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶，在凋亡過(guò)程中起決定性的調(diào)控作用。海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡參與抑郁病程[24]。慢性輕度壓力（CMS）動(dòng)物模型表明[25]，抑郁樣行為伴有神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元損傷、細(xì)胞凋亡和海馬神經(jīng)發(fā)生減少。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果，槲皮素與上述靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合活性，且槲皮素、木犀草素與MMP9靶點(diǎn)作用最強(qiáng)。由此可推測(cè)，六郁湯槲皮素、木犀草素為六郁湯抗抑郁的核心成分，且主要靶向氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁作用。

GO 功能富集的生物過(guò)程（BP）主要涉及外源刺激反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來(lái)源分子反應(yīng)等，與炎癥反應(yīng)相關(guān)，此外，脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、AGE-RAGE 信號(hào)通路、PI3K-Akt等信號(hào)通路為顯著富集的通路。Miao G 等[26]發(fā)現(xiàn)，脂類代謝改變可能通過(guò)增加酸性鞘磷脂酶和磷酸脂酶的活性，干擾神經(jīng)遞質(zhì)和膜信號(hào)，增強(qiáng)炎癥，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化作用，和/或影響脂滴或膜形成中的能量?jī)?chǔ)存，從而影響抑郁癥。AGE-RAGE 信號(hào)通路可激活PI3K/Akt、MAPK/ERK 和NF-κB 等多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子、趨化因子和粘附分子的表達(dá)增加，并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[27]。PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B）信號(hào)通路是治療抑郁癥的重要級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，也是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞存活、分化及凋亡的重要信號(hào)通路之一，也是多種抗抑郁中藥的靶點(diǎn)通路[28]?？挂钟糁兴幙梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而影響上述過(guò)程，從而發(fā)揮抗抑郁作用。另外，炎性細(xì)胞因子可影響氧化應(yīng)激、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌等多個(gè)下游生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)抑郁癥的發(fā)生及發(fā)展。IL-17[29]、TNF-α[30]等炎癥相關(guān)信號(hào)通路也在抑郁癥的病理生理學(xué)和抗抑郁治療機(jī)制中發(fā)揮著不可或缺的作用，六郁湯也可以靶向上述炎癥相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，六郁湯可能通過(guò)調(diào)控AKT1、IL1B、TP53、CASP3、MMP9 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，介導(dǎo)脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PI3K/Akt、IL-17 等信號(hào)通路，通過(guò)抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)突觸形成、抑制神經(jīng)元凋亡等途徑，發(fā)揮抗抑郁作用，具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路等協(xié)同作用機(jī)制特點(diǎn)。但本研究?jī)H從微觀角度探討了六郁湯抗MDD 的作用機(jī)制，研究結(jié)果仍有待進(jìn)一步的臨床和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使其臨床應(yīng)用更具有指導(dǎo)意義。