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        復(fù)合酶-超聲波輔助提取火龍果花黃酮及抗氧化性研究

        2023-11-01 09:22:46張中華徐西俊陳鳳真
        中國果菜 2023年10期
        關(guān)鍵詞:液料火龍果提取液

        張中華,徐西俊,陳鳳真*,阮 帝,李 霞,何 盈

        (1.菏澤市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,山東菏澤 274000;2.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,山東菏澤 274000)

        火龍果(Hylocereus undatusBritt)是仙人掌科植物[1]?;瘕埞慷浠ㄙ|(zhì)量達(dá)600~800 g,因此被稱為“大花王”[2]。火龍果花富含營養(yǎng)元素和生物活性成分,具有抑菌、消炎、清火、潤肺、止咳、增強(qiáng)免疫力、降血糖、治療高尿酸癥等作用[3-4];其所含的黃酮具有抗氧化[5]、抗炎[6-7]、降血脂及預(yù)防動脈粥樣硬化等生物活性[8-9]。目前,火龍果花在我國的主要利用方式是食用,食用人群主要集中在南方地區(qū),北方地區(qū)很少有人食用。近年我國北方逐漸擴(kuò)增火龍果種植面積,產(chǎn)生大量的火龍果花,被疏掉的花朵極少一部分被食用,大部分被作為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物丟棄,造成資源浪費。目前關(guān)于火龍果花黃酮的研究不多。李國勝等[10-11]以乙醇為溶劑,采用正交試驗建立了火龍果花的提取工藝條件,測定黃酮含量為2.787 mg/g,研究結(jié)果表明火龍果花具有較強(qiáng)的抗氧化性。羅小艷等[12]建立了黃酮的最佳提取條件,提取的火龍果花中黃酮含量為0.747%。單一乙醇提取法提取率較低,超聲波輔助提取具有提取效率高、能耗低、保護(hù)環(huán)境等優(yōu)點[13]。酶輔助超聲波提取結(jié)合超聲波法和酶法的優(yōu)點可以縮短提取時間、提高提取效率,條件溫和,節(jié)約能源。

        本文以火龍果花為研究對象,采用復(fù)合酶-超聲輔助提取,對影響黃酮提取率的因素進(jìn)行了單因素試驗分析,然后利用Plackett-Burman 設(shè)計對單因素進(jìn)行顯著分析,對影響顯著的因素采用響應(yīng)面法優(yōu)化火龍果花黃酮提取工藝。最后通過對ABTS+·、超氧陰離子清除能力評價黃酮的體外抗氧化活性,以期為火龍果花的綜合利用提供理論依據(jù),提高火龍果花附加值,促進(jìn)火龍果花黃酮在功能性食品和醫(yī)藥中的應(yīng)用。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        將市場購買的干燥紅皮白肉品種火龍果花粉碎,過80 目篩,在通風(fēng)處用石油醚進(jìn)行脫脂處理12 h,回收石油醚,抽濾,烘干。

        1.2 試劑

        2,2- 聯(lián)氮- 二(3- 乙基- 苯并噻唑-6- 磺酸)二銨鹽2,2’-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)ammonium salt,ABTS,純度98%、纖維素酶(50 U/mg)、果膠酶(50 U/mg),上海阿拉丁生化科技股份有限公司,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(京壇墨-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)檢中心),其它所用化學(xué)試劑均為分析純。

        1.3 火龍果花黃酮的提取與含量測定

        精確稱量經(jīng)預(yù)處理的火龍果花粉末,加入乙醇提取液與酶液,超聲輔助提取,5 500 r/min 離心8 min 后,取上清液1 mL,然后加入樣品溶液用于測試。所有實驗處理均為重復(fù)3 次。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定火龍果花中的黃酮含量[14]。配制濃度梯度為80~200 μg/mL 的蘆丁溶液,在510 nm 處測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=0.007X-0.002 3,R2=0.998 7,回歸方程可用。黃酮提取率計算公式見式(1)。

        式中,c為提取液黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V2為測定時反應(yīng)體系的體積,mL;V1為提取液的體積,mL;V3為測定時吸取的體積,mL;m為稱取的樣品的質(zhì)量,mg。

        1.4 單因素試驗

        固定纖維素酶∶果膠酶酶比為2∶1,加酶量2 000 U/g,pH 值5,超聲溫度30 ℃,超聲時間40 min,依次以乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1,mL/g)、酶解時間(30、60、90、120、150 min)、酶解溫度(45、50、55、60、65℃)與超聲功率(150、180、210、240、270 W)為變量進(jìn)行單因素實驗,以確定的上一個因素最佳工藝條件固定不變,其它條件不變。

        1.5 篩選試驗與響應(yīng)面試驗設(shè)計

        以單因素試驗結(jié)果為依據(jù),從液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解時間、酶解溫度、超聲功率共5 個因素中篩選出對提取率影響顯著的因素。以黃酮提取得率為評價指標(biāo),然后對影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

        1.6 抗氧化性測定

        ABTS+·的測定:參考王思溥等[15]和Zhou 等[16]方法。

        超氧陰離子的測定:參照郭雪峰等[17]和Marklund等[18]的方法。

        1.7 數(shù)據(jù)處理

        單因素試驗數(shù)據(jù)處理與作圖使用Excel 2010 軟件;單因素顯著性采用SPSS 21 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析;方差分析與響應(yīng)面繪圖分別采用Design-Expert 12 和Origin 2018 軟件分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗

        2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響

        由圖1 中可以得到,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,黃酮得率先上升后下降再上升,當(dāng)達(dá)到70%時,得率達(dá)到最大為9.41%;較低或較高的乙醇體積分?jǐn)?shù),其極性均不利于黃酮的溶出,此外高濃度的乙醇還會加大其他醇溶性物質(zhì)的溶出,對火龍果花黃酮產(chǎn)生競爭性抑制溶出從而影響黃酮類化合物的提取率[14]。因此,確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

        圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對火龍果花黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

        2.1.2 液料比對黃酮提取得率的影響

        從圖2 中可知,隨著液料比的增大,黃酮提取得率增加;由于提取體積小,酶與底物未能充分接觸,使一部分樣品未能完全浸出,因此提取率較低[14],適當(dāng)?shù)囊毫媳忍岣吡嘶瘕埞S酮的提取得率。當(dāng)液料比為50∶1(mL/g)與40∶1(mL/g)時,黃酮提取得率差異不顯著;考慮到降低提取成本和對環(huán)境的污染,因此選擇最佳提取液料比為40∶1(mL/g)。

        圖2 液料比對火龍果花黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

        2.1.3 酶解時間對黃酮提取得率的影響

        由圖3 可知,黃酮提取得率隨酶解時間延長先升高后下降,酶解90 min 時,黃酮提取得率最高,為8.04%;這可能由于酶解底物溶出需要一定時間,時間短,黃酮溶出不徹底,提取率較低;當(dāng)酶解超過90 min 后,雜質(zhì)溶出也增多,雜質(zhì)可能與黃酮發(fā)生反應(yīng),導(dǎo)致提取率下降。因此最佳酶解時間為90 min。

        2.1.4 酶解溫度對黃酮提取得率的影響

        如圖4(見下頁)所示,火龍果花黃酮提取得率隨著酶解溫度的升高先上升后下降。50 ℃的提取得率顯著高于其它處理,這可能是由于酶解溫度為50 ℃時,復(fù)合酶的活性最高,使黃酮高效地游離在溶液中;酶解溫度進(jìn)一步上升會使酶活性降低或部分失活,導(dǎo)致黃酮提取率下降。因此確定最佳酶解溫度為50 ℃。

        圖4 酶解溫度對火龍果花黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

        2.1.5 超聲功率對黃酮提取得率的影響

        圖5 顯示,隨著超聲波功率的增大,火龍果花黃酮的提取得率先升高后下降。超聲波功率較低時,超聲波空化產(chǎn)生的壓力小,細(xì)胞破碎不完全,黃酮提取得率較低;隨著超聲波功率的增大,由細(xì)胞液中的空化作用而產(chǎn)生更多的空化泡,使破碎作用增強(qiáng),黃酮提取得率增加[14]。當(dāng)超聲功率超過240 W 時,可能用于功率太大,破壞了黃酮結(jié)構(gòu),導(dǎo)致提取得率下降。因此,超聲波輸出功率在240 W 時提取效果最佳。

        圖5 超聲功率對火龍果花黃酮提取得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of total flavonoids from pitaya flower

        2.2 Plackett-Burman 篩選試驗結(jié)果

        由表2、3 可知,模型P<0.01,說明模型極顯著,模型可以反映黃酮得率隨各因素的變化情況;模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.951 7,說明方程的擬合度極好,能真實地反映四個變量與黃酮提取得率的關(guān)系;R2Adj(調(diào)整確定系數(shù))為0.911 5,說明該方程能解釋91.15%響應(yīng)值的變化,R2pre為0.807 0,反映了預(yù)測值與實際值有較高的相關(guān)性。乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時間對火龍果花黃酮提取率達(dá)到極顯著影響,液料比達(dá)到顯著影響,其它因素影響不顯著。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解時間與液料比這三個顯著或極顯著因素作為響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計的變量,設(shè)定酶解溫度為50℃、超聲功率為240W。

        表2 Plackett-Burman 試驗設(shè)計Table 2 Test design of Plackett-Burman

        表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計的方差分析Table 3 Analysis of variance of Plackett-Burman test design

        2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化火龍果花黃酮的提取工藝

        2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

        以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時間作為響應(yīng)變量,以黃酮提取率作為響應(yīng)值,采用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行分析,建立二次回歸多元方程為Y=-6.882 5+0.74492A-0.16222B+0.13903C+0.00045AB-0.002775AC+0.001 191 67BC-0.006 31A2+ 0.000 64B2-0.000 80C2。響應(yīng)面試驗結(jié)果見表4。

        表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 4 The results of response surface test

        由表5 中可看出,模型回歸極顯著,失擬項不顯著,說明模型是有效的,可以很好地分析數(shù)據(jù);該模型R2=0.979 3,R2Adj=0.952 6,說明模型擬合程度高,能擬合97.9%的實驗數(shù)據(jù),較好地反映各因素與提取率之間的關(guān)系;可以用此模型來確定火龍果花黃酮的最佳提取工藝條件。三個因素的一次項均達(dá)到了顯著或極顯著水平,說明三個因素對黃酮提取率影響顯著,線性效應(yīng)明顯;液料比與酶解時間的二次項對黃酮提取率極顯著(P<0.01),說明對黃酮提取得率影響較大;從F值可以看出,對黃酮提取率影響最大的是酶解時間,其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)。

        表5 Box-Behnken 方差分析表Table 5 Box-Behnken analysis of variance

        2.3.2 響應(yīng)面各因素間的交互分析

        從圖6(見下頁)中可看出,火龍果花黃酮提取率隨液料比的增大先升高后下降,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高;乙醇提取分?jǐn)?shù)的曲面坡度較液料比的曲面陡,即乙醇濃度曲面傾斜度高,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響大于液料比;等高線為橢圓形,說明液料比和酶解時間交互作用較強(qiáng);隨酶解時間的延長與液料比的增大,火龍果花黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢;液料比曲面坡度較酶解時間的曲面平緩,說明液料比對黃酮提取率的影響小于酶解時間,這與方差結(jié)果一致。火龍果花黃酮提取率隨酶解時間的延長先升高后下降,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而升高;酶解時間曲面傾斜度高,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響小于酶解時間。

        圖6 不同因素交互作用對黃酮提取得率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graphs of the interactive effects from different factors on the yield of flavonoids

        2.3.3 最佳工藝條件

        通過Design-Expert 12 軟件的響應(yīng)面優(yōu)化得到火龍果花黃酮提取率的理論值最大為10.36%,最佳條件為液料比48.07∶1(mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)79.99%、提取時間62.84min。為便于實際操作,調(diào)整液料比48∶1(mL/g),乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,酶解時間63 min。依照此工藝條件進(jìn)行5次重復(fù)試驗,得到火龍果花黃酮的提取率為10.28%,與預(yù)測值接近,說明Box-Behnken 設(shè)計響應(yīng)面法得到的提取條件可靠,可用來預(yù)測火龍果花黃酮的提取得率。在此條件下黃酮提取率高于李國勝等[10]和羅小艷等[12]研究結(jié)果,說明復(fù)合酶-超聲波輔助提取方法比上述方法的黃酮提取率高。

        2.4 火龍果花黃酮抗氧化活性測定

        由圖7 可知,火龍果花黃酮提取液和VC 溶液對ABTS+·清除率變化一致,隨著質(zhì)量濃度的增加,對自由基清除率上升;在黃酮提取液濃度為1.2 mg/mL 時,對ABTS+·清除率為45.65%;說明火龍果花黃酮能提供較多的活性氧,從而更多的ABTS+·被清除[19-21]。在同一質(zhì)量濃度下,VC 溶液對這兩種自由基的清除能力高于火龍果花黃酮提取液,說明火龍果花黃酮提取液具有一定的抗氧化性,但比VC 抗氧化性弱。

        圖7 火龍果花黃酮對ABTS+·的清除率Fig.7 ABTS+·scavenging rate of flavonoids in pitaya flower

        超氧陰離子可以使細(xì)胞的膜相系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化,生成其他氧自由基,從而損傷機(jī)體引起疾病[19]。由圖8可知,火龍果花黃酮提取液和VC 溶液對超氧陰離子的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而升高;火龍果花黃酮提取液在0.15~1.20 mg/mL 時,其清除率從21.67%上升到39.67%;火龍果花黃酮提取液對超氧陰離子的清除率低于同一質(zhì)量濃度VC 溶液的。

        圖8 火龍果花黃酮對超氧陰離子的清除率Fig.8 Superoxide anion scavenging rate of flavonoids in pitaya flower

        3 結(jié)論

        本研究建立了復(fù)合酶-超聲波輔助提取火龍果花黃酮的方法。在單因素試驗基礎(chǔ)上,經(jīng)Plackett-Burman 試驗篩選出對火龍果花黃酮提取率影響顯著的三個因素為液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和酶解時間。通過響應(yīng)面優(yōu)化得到火龍果花黃酮提取的最佳條件為液料比48∶1(mL/g),乙醇體積分?jǐn)?shù)80%,酶解時間63 min,在此優(yōu)化條件下黃酮提取率為10.28%;火龍果花黃酮有較好的抗氧化作用,可以作為食品、日化品與藥品的原料,為提升火龍果花制品的附加值提供更多途徑,合理利用果品廢棄物,使之變廢為寶,延長產(chǎn)業(yè)鏈,促進(jìn)火龍果產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。

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